EDTA依赖性血小板假性减少的实验分析及应对措施

[摘要] 目的 分析使用血细胞分析仪检测血小板计数出现假性减少的原因及复查方法。方法 根据该实验室复检标准，采用血小板出现假性减少的50例门诊或住院患者作为研究对象，分析假性减少的原因及其复查方法。 结果 50例血小板假性减少样本中，42例为乙二胺四乙酸依赖性，3例为大血小板，2例白细胞周围卫星现象，3例冷凝集现象，对这些患者进行复查后可得到正常范围的血小板结果。 结论 EDTA-PTCP患者经镜检涂片发现聚集现象，可用枸橼酸钠抗凝、无抗凝剂即刻上机、手工计数复查血小板数值以避免误诊。

[关键词] 血小板计数；血小板聚集；血小板假性减少；EDTA

[中图分类号] R55 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2016）12（b）-0049-04

（Pseudo thrombocytopenia，PTCP）是一种体外多病因的现象，包括抗凝相关的血小板凝集、大血小板、血小板卫星现象、冷凝集、微小的凝块等。乙二胺四乙酸（EDTA）是临床实验室广泛应用于全血细胞计数及分类的一种最理想抗凝剂，同时也是引起血小板聚集而假性减少最常见的原因。乙二胺四乙酸依赖性假性血小板减少（EDTA -PTCP）导致血细胞计数仪无法准确计数而出现血小板数量减少或明显减少现象，据文献报道[1]其发生率为0.09%～0.21%。检验出现假性减少结果会造成临床患者的误诊、误治，可能给患者造成不必要的骨髓穿刺和不恰当的治疗，如输注血小板，激素，甚至脾切除等[2]。此种假性PLT减少一般不需要治疗，但在实际临床工作中需要与真性血小板减少相鉴别，通过检验科人为手段进行对患者的血常规进行特殊流程处理及纠正PLT结果，可以减少患者不必要的辅助检查和治疗，因此研究EDTA-PTCP正确的诊断方法来提高检验人员血小板计数的准确性的能力，避免误导临床医生对患者的诊断和治疗具有非常重要的意义。该研究报道近2年42例发现为EDTA-PTCP患者的实验室结果分析及应对措施报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有血常规标本来自该院2014年6月—2016年6月门诊及住院患者。于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的真空管中静脉采血2 mL，充分混匀后在血细胞分析仪上按程序进行检测，按本科室标准操作规程（SOP）文件的复检规则，对血小板低于70×109/L的标本进行手工涂片复检，发现血小板明显凝集现象均重新抽血复查。共收集50例EDTA所致的假性血小板减少病例，其中男32例，女18例，年龄1～74岁，平均36岁。ICU科3例，妇产科4例，儿科7例，风湿科3例，呼吸内科4例，消化内科2例，神经内科2例，肾内科1例，心内科2例，血液科8例，外科7例，门诊/急诊7例。其中42例EDTA依赖性致血小板假性减少症，3例聚集的为大血小板患者，2例血小板卫星现象，3例为冷凝集诱发的聚集。

1.2 仪器与试剂

采用希森美康血细胞分析仪（Sysmex XT4000i），试剂为希森美康专用血球原装配套试剂试剂和相关质控品。用（OLYMPUS CX31 ）显微镜油镜下观察PLT聚集分布和形态。

1.3 标本采集

用EDTA-K2抗凝采集2 mL全血充分混匀，实验前仪器室内质控在控且标本测定在1 h内完成。对符合筛选标准的患者标本，排除标本凝固问题和检测随机误差外，对确认血小板聚集的患者再次采集枸橼酸钠抗凝和无抗凝剂各1管。该研究所用真空采血管均由 湖南省浏阳市医用科技发展有限公司提供。

1.4 涂片染色镜检及手工稀释计数

EDTA抗凝全血涂片后用瑞氏-姬姆萨染液（自配）染色及镜检；手工稀释计数为在清洁试管中加入稀释液0.38 mL草酸铵（自配）加准确吸取20 μL无抗凝剂全血，进行手工计数血小板，方法均依据《全国临床检验操作规程》第3 版[3]。

1.5 统计方法

处理采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，检测值以均数±标准差（x±s）表示；4种复查方法学差异性比较采用配对t检验；计数资料比较采用χ2检验。

2 结果

EDPA依赖性致血小板假性减少症（EDTA-PTCP）共有42例。该42例标本首次采血后上机检测结果血小板计数均低于80×109/L，取EDTA采样的抗凝血涂片染色后镜检，低倍镜下可见血小板聚集，成团或成小堆存在，油镜下可见数量较多的血小板聚集现象。对此患者当场抽血2管，未加任何抗凝剂管立即上机检测，枸橼酸钠抗凝管2 min之内上机检测，结果均在正常范围，与手工计数结果一致，均與首次上机检测结果比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。用SPSS软件对复查方法进行配对t检验结果显示，枸橼酸钠抗凝与即刻上机复查，差异有统计学意义（P=0.021 <0.05），即刻上机复查与手工计数复查，差异有统计学意义（P=0.042 <0.05）。

2.2 其他原因组的结果分析

大血小板致血小板计数减少共3例，首次上机检测及枸橼酸钠抗凝复查血小板结果均低于50×109/L，血细胞分析仪血小板直方图2例出现聚集报警。涂片镜下观察，易见大血小板或较大血小板有聚集现象。手工计数或未加抗凝剂抽血立即上机后结果正常，与涂片估算结果较一致。血小板卫星现象共2例，1例为仪器聚集报警，油镜下观察可见血小板附在中心性分叶核白细胞周围，手工计数结果在正常范围。冷凝聚3例，首次结果均未能检测，将该标本至37 ℃水浴30 min后上机检测，血小板的结果在正常范围；另外枸橼酸钠及无抗凝剂均在37 ℃水杯中进行上机检测，结果均有低于100×109/L，仪器血小板未见聚集提示，手工计数结果均在正常范围。

2.3 血小板直方图及警报提示信息进行分析

对首次EDTA抗凝检测结果中血小板直方图出现翘尾，警报框出现“血小板聚集？”等为有聚集提示，结果发现EDTA-PTCP组76.2%的血小板假性减少在血细胞分析仪上可出现聚集报警，见表2。采用χ2检验，计算得出，差异有统计学意义（χ2=12.77， P<0.05）。

3 讨论

在该院2014年6月—2016年6月期间住院的26 923例患者，在他们进行血常规分析中发现42例EDTA -PTCP病例，其发生率为0.156%。与文献报道[1，4]的发生率基本一致。该研究筛查患者血小板计数低于70×109/L的病例，同时对其进行了血小板直方图观察和显微镜检查有无聚集。可能漏检一些血小板检测数量较高即使因EDTA原因聚集却未降至70×109/L以下的病例，推测实际发生率可能会更高。排除血小板减少症患者，已经有学者[5]提出了几种方法来防止血小板凝聚，如使用替代抗凝剂包括枸橼酸钠、肝素等。从该文表1结果表明，42例EDTA -PTCP可以用枸橼酸钠抗凝或無抗凝剂抽血立即上机可以加以纠正，其纠正数值手工计数结果相接近，与冯戟等[6-7]研究结果一致。用配对t检验比较4种检测血小板的均值（P<0.05），结果表示EDTA抗凝与枸橼酸钠抗凝剂、无抗凝剂即刻上机及手工计数检测血小板数值均有显著性差异。对于使用枸橼酸抗凝计数血小板标本尽快检测对结果影响较少，与Lin J等[4]研究要求在10 min内检测要求相近。另外该研究发现2例大血小板聚集患者对枸橼酸钠也发生聚集现象，有研究报道[8]枸橼酸钠抗凝血也可引起PLT计数假性减少，但对其引起血小板假性减少的机制尚不清楚。该研究中42例EDTA -PTCP患者标本EDTA抗凝上机PLT直方图90.5%提示聚集报警，但血涂片均见PLT明显聚集现象。大血小板、血小板卫星现象及冷凝集素引起血小板假性减少现象较少见，病例数非常有限，仪器提示聚集报警率较低37.5%。其中2例大血小板患者中使用枸橼酸钠抗凝，检测结果仍很低，经涂片血小板发现也有5～10个聚集情况，其发生机制也不明确。

EDTA-PTCP的发病机制比较复杂，目前病理生理尚不十分清楚。EDTA诱导PTCP在1969年首次由Gowland 等人报道，根据Lin J等或Shabnam I 等的研究[4，9]提及Ca2+的螯合作用可以使Ca2+依赖的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，由于EDTA表面糖蛋白和阴离子磷脂引起的改变，在抗血小板抗体结合的作用下诱导血小板聚集。有学者[2]推测可能是某些EDTA-PTCP患者血浆存在自身抗体抗、抗心磷脂抗体、血小板抗体以及血小板表面可能存在的某些与聚集相关隐匿性抗原等，导致血小板发生聚集。有学者研究表明EDTA-PTCP患者血小板聚集与EDTA抗凝时间及室内温度有关，时间越长温度越低现象越频繁。另外对EDTA-PTCP患者的危险因素已被广泛研究，住院治疗，药物治疗或潜在的疾病被认为是增加EDTA-PTCP患者危险因素[10]。Saigo K等的综述研究[11]提及EDTA-PTCP患者可能与自身免疫性疾病，病毒和细菌感染、慢性肝疾病，代谢综合征，恶性肿瘤等疾病有关，然而没有研究明确具体的疾病和EDTA-PTCP患者的发生密切相关。

对EDTA-PTCP患者误诊的可能存在以下原因：①血小板减少的复查制度及处理流程不够完善；②科员对血涂片镜检及手工计数血小板的能力有待提高；③住院患者血常规标本采集到上机检测的时间较长，导致血小板聚集更显著；④部分检验人员及临床医生对EDTA-PTCP认识不足、重视不够，两者可能沟通不到位等。因此必须提高医务人员对EDTA-PTCP患者的应对策略，具体措施如下：①本科室的血小板减少的复查制度：PLT>1 000×109/L或PLT<70×109/L或仪器提示血小板聚集及血小板直方图有翘尾异常均要涂片镜检复查。该科室处理流程为对于镜检血小板有聚集疑似EDTA-PTCP患者，首先查看标本质量是否合格，是否出现凝块；同时查看仪器提示警报是否出现提示PLT聚集及PLT直方图异常；第二与临床医生或患者沟通是否出现皮肤紫癜、淤点淤斑、牙龈出血、鼻出血、胃肠道出血等PLT减少病症，当血小板减低与患者临床症状或病史不符则必须涂片染色镜检[10]；第三显微镜观察血小板分布情况，如易见血小板成团或成小堆聚集则通知患者重新采血手工计数复查或重新抽血无抗凝剂或枸橼酸钠抗凝的真空管立即上机复查3种方法选其中一进行复查，必要时选两种）。②加强科员对PLT镜检及手工计数的检验能力，重要的是识别血小板计数假性减少的能力，初步结合仪器报警提示、PLT直方图、血涂片镜检综合分析及时有效处理，避免患者不必要的治疗。③检验人员提高工作责任心，高度重视PLT假性减少病例，加强与临床医患人员沟通交流。④对于出现冷凝集素、大血小板、血小板卫星现象所引起的血小板假性减少，可进行草酸铵法手工计数血小板进行纠正更为准确[12]。手工计数法是血小板测定的参考方法，虽然精密度与仪器相比较差，但可计数2～3次取均值来减少实验误差，是对血小板假性减少的复查中一种经典有效的方法。⑤用枸橼酸钠抗凝剂或无抗凝剂立即上机进行血小板计数复查，可能检测结果与手工计数结果存在一些差异，同时不能作为结果报告仅供检验人员复查参考，但其对于排除EDTA-PTCP引起的血小板假性减少也是可行的快捷方法。

综上所述，当出现血小板计数结果减少、仪器有报警提示或者PLT直方图有异常时，检验人员应引起足够重视，采取相应的措施进行全面、综合的复查处理，避免发出错误检验结果，必须为临床医患人员提供正确可靠的检验报告，减少医疗纠纷构建和谐医患关系。但目前EDTA-PTCP 发生的机制不是很明确[4]，如抗血小板抗体产生的关键因素，血小板在受EDTA抗凝剂作用后的变化机制，EDTA诱导血小板聚集与抗凝时间、温度还没有很好的定论，为何这种聚集现象只发生在极少数人，与疾病、用药、机体本身抗体或相关生化免疫指标有何关联等都有待进一步探讨研究。

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（收稿日期：2016-09-14）