安可胶的主体免疫成分鉴定
[摘要] 目的 通过对安可胶的主体成分鉴定，为该药物临床进一步优化和应用提供实验依据。方法 通过建立ELISA检测条件系统，确定一抗与二抗最佳工作浓度，对兔血清抗体进行检测及点杂交鉴定。 结果 安可胶作用于兔，可使其产生纤维蛋白原抗体，抗体滴度也呈相同的变化趋势。结论 经鉴定，安可胶的主体成分是纤维蛋白原蛋白，该纤维蛋白原成分对于啮齿类兔可诱发一过性抗体，但未表现出其他明显的免疫原性反应。
[关键词] 安可胶；纤维蛋白原；抗体
[中图分类号] R93 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2016）02（a）-0143-03
Main Immune Ingredients Identifications of Ankejiao
SI Wei1，XU Ci-zhong2，LIU Jing3
1.NanJing Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Province，Nanjing，Jiangsu Province， 210000 China；2.Nanjing catering and food safety administration，Nanjing，Jiangsu Province， 210000 China；3.Jiangsu Provincial Institute of Material Medical，Nanjing，Jiangsu Province， 210000 China
[Abstract] Objective To investigate the main ingredients identifications of Ankejiao and provide experimental evidence for evaluation and further optimization of the drug. Methods An improved ELISA system of biotin and conjugated streptomyces avidin was used for detecting antibodies. The serum antibody titer and its dynamics were studied by means of the injury experiment in New Zealand rabbits. Results The antibodies could be detected in New Zealand white rabbit serum 1 week after immunization， and antibody levels decreased to a more stable level after it peaked at the second week， at the same time， the antibody titer also showed the same trend. Conclusion The humoral immune response was induced in New Zealand rabbits after stimulated with porcine fibrinogen， but no specific immune response was found in rabbits.
[Key words] Ankejiao； Fibrinogen； Antibody
安可胶是模仿凝血机制的最后共同通路设计成的止血制剂，由两种溶液组成，溶液A含高浓度的纤维蛋白原和XIII因子，溶液B主要含凝血酶和钙离子，当上述两液混合时，产生类似外凝血过程的最后阶段，纤维蛋白原和凝血酶接触，产生可溶性纤维蛋白多聚体，并形成纤维蛋白网，起到止血封闭作用，使出血停止，适用于创面止血、防淋巴漏，并能有效促进创面愈合。但由于本品来源于哺乳动物血清，因此对其免疫原性研究显得尤为重要。该研究旨在对安可胶进行主体免疫成分进行鉴定，同时通过免疫原性试验，观察其对免疫系统的影响，为临床用药安全提供参考依据。
1 材料
1.1 实验动物
普通级新西兰兔24只，雌雄各半，随机分4组，每组6只。
1.2 主要试剂
纤维蛋白原多克隆抗体：Millipore公司提供，批号PS1424939 蛋白质分子量标准：Fermentas公司提供，批号00034120辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG：凯基生物科技发展有限公司提供，批号140403。
2 试验方法
试验剂量采用安可胶 20 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg，溶于适量的纤维蛋白原溶解液中；凝血酶冻干粉1瓶，溶于适量的凝血酶溶解液中，得到相应浓度的应用液。
2.1 SDS-PAGE电泳分离安可胶的主体成分
精密称取1 mg安可胶，加入1 mL双蒸水，超声溶解，配成1 mg/mL的溶液。取20 mL上述溶液加入5 mL 非还原型上样缓冲液充分混匀，即为电泳样品。
制备电泳凝胶，分离胶浓度8%，浓缩胶浓度5%。取上述电泳样品10 mL上样，恒压70 V下至溴酚蓝前沿完全跑出底边。电泳结束后将胶取出，以考马斯亮蓝染色30 min后换脱色液，置于脱色摇床上脱色，直至背景澄清，条带清晰后拍照。
2.2 Western Blot鉴定主体成分
电泳结束后将胶取出，以恒流300 mA转膜2 h 40 min至硝酸纤维素膜后，将膜取下放入5%BSA/PBST中，37 ℃轻摇封闭1 h。封闭结束后将膜取出，用PBST洗涤三次，5 min/次，之后将膜放入封口袋中，加入1：5000稀释的纤维蛋白原多克隆抗体，4 ℃封闭过夜。第二天取出后按上述方法洗涤完后加入1：4000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，37 ℃下孵育1 h后取出洗涤，在膜上用TMB法显色后拍照。
2.3 ELISA检测条件的建立
2.3.1 间接ELISA操作步骤 用包被缓冲液稀释后加至96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。第二天倒去包被液，用洗涤缓冲液加至孔内，洗涤5次，3 min/次，然后加入封闭液200 μL/孔，置37 ℃封闭1 h；封闭结束后倒掉液体，同样洗涤液洗涤5次，加入抗体稀释液稀释的纤维蛋白原多克隆抗体（一抗）100 μL/孔，置37 ℃孵育2 h；洗涤5次，加入抗体稀释液稀释HRP标记羊抗兔IgG （二抗） 100 μL/孔，置37℃孵育1h；洗涤5次，加入TMB显色液100 μL/孔，避光反应10 min；加入2 M硫酸溶液50 μL/孔终止反应，于酶标仪450 nm处测定A450值。
2.3.2 纤维蛋白原最佳包被浓度的选择 纤维蛋白原冻干粉用包被缓冲液稀释后包被酶标板，纤维蛋白原多克隆抗体、HRP标记羊抗兔IgG均使用1：5000的稀释度，根据A450值的变化趋势选择合适的包被浓度。
2.3.3 一抗与二抗最佳工作浓度的确定 一抗与二抗最佳工作浓度的确定采用棋盘滴定法。以确定的纤维蛋白原最适包被浓度包被酶标板，10%小牛血清封板，同时设空白对照与阴性对照（均为3个平行复孔），一抗选用1：2500、1：5000、1：10000三个稀释度，二抗选用1：2000、1：4000、1：8000稀释度，各稀释度交叉配组（即9个组），参照上述步骤进行试验，根据A450值选择P/N比值最大的配对组条件为一抗和二抗最适工作浓度。
2.4 兔切口实验及兔血清抗体的检测
24只新西兰大白兔随机分为4组，用安可胶封闭后1、2、4、6周采血分离血清，按上述建立的ELISA条件检测血清中抗体。各组血清分别作1∶100稀释，以阴性照组血清为阴性对照，P/N>2.1 为阳性，血清作梯度稀释，以最高稀释度为血清抗体滴度。
2.5 点杂交法鉴定血清中抗体成分
取四张硝酸纤维素膜，分别在膜上同一位置各滴加上述溶液2 mL，37 ℃孵育20 min，待膜干后加入含10%小牛血清的PBST溶液37 ℃下封闭1 h。封闭结束后用PBST洗膜3次，5 min/次。将高、中、低三个剂量组以及阴性对照组的兔血清作1：100稀释，洗涤完毕后的膜分别用这四种血清37 ℃孵育1 h。洗膜3次，再加入1：4000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，37 ℃下孵育1 h，洗膜3次，在膜上滴加TMB显色液显色。
2.6 统计方法
采用SPSS19.0软件中one-way ANOVA进行统计分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 SDS-PAGE及Western Blot结果
电泳结果显示，纤维蛋白原冻干粉条带对应的分子量约为340KD，与纤维蛋白原理论分子量较为吻合。Western Blot结果说明，只有唯一的一处条带能被纤维蛋白原多克隆抗体所识别。综合以上两点，可以证明安可胶的主体成分为纤维蛋白原蛋白。
3.2 纤维蛋白原最佳包被浓度
纤维蛋白原包被浓度在0.5～10 μg/mL时，A450值呈递增趋势，且当包被浓度为10 μg/mL时，A450值接近于1。当包被浓度>10 μg/mL时趋于饱和，故本试验将10 μg/ml纤维蛋白原作为最佳包被浓度。
3.3 一抗与二抗最佳工作浓度
一抗和二抗的最适稀释度分别为1∶2500和1∶4000。此时A450值较大（1.0左右），阴性本底较低（<0.2），P/N最大，详见表1。
3.4 兔血清点杂交
给于安可胶的兔血清能特异性地与纤维蛋白原结合，斑点亮度明显高于阴性对照组，表明血清中主要的抗体成分为纤维蛋白原抗体，而且存在一定的剂量依赖性。从时间上来看，第一、二、四周血清中抗体含量呈上升趋势，第六周开始下降。
3.5 兔血清抗体检测
给予安可胶一周后，血清中即可检测出抗体存在，并且高、中剂量组与阴性相比有显著性差异。第二周、第四周低剂量组抗体含量呈显著性上升趋势，而高、中剂量组变化较小。第六周各组抗体含量呈现下降，详见表2。
3.6 兔血清抗体滴度检测
试验结果表明，随着时间的推移，各组血清中抗体滴度均呈先上升后下降趋势。第一周，高、中、低剂量组抗体最低滴度分别为1：400、1：200、1：200；第二周，高、中、低剂量组抗体最低滴度分别为1：1600、1：1600、1：800；第四周，高、中、低剂量组抗体最低滴度分别为1：3200、1：3200、1：3200；第六周，高、中、低剂量组抗体最低滴度分别为1：1600、1：1600、1：1600。
4 结论
安可胶的主体免疫成分（纤维蛋白原冻干粉）是纤维蛋白原蛋白；安可胶作用于兔，第一周各剂量组就能产生抗体，经鉴定为纤维蛋白原抗体，并且低剂量组在第二、四周抗体含量呈显著性上升，而高、中剂量组抗体含量变化不明显，可能是由于较高剂量使机体产生了耐受，第六周时，各组抗体含量开始下降。各组抗体滴度呈现出先上升后下降的变化趋势。该研究结果表明，纤维蛋白粘合剂中的纤维蛋白原成分对于啮齿类兔可诱发一过性抗体。
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（收稿日期：2015-11-02）
