优化的SDS法提取刺五加基因组的研究

摘要：目的：探索出利用十二烷基硫酸钠（SDS）提取刺五加基因组的最佳工艺条件，为今后提取多酚、多糖及其它次生代谢产物多的植物基因组提供参考。方法：采用正交试验对提取溶剂NaAc的浓度、SDS提取液中NaCl的浓度、SDS的含量等条件进行优化。对DNA的提取效果，采用紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳检测进行分析。结果：OD260/OD280为1.817，无蛋白质和 RNA 污染。得率为6.138ng/mg，浓度为102.3ng/L。即改良的最佳方案是NaAc的浓度为2.5mol/L，SDS的含量为2.5%，SDS提取液中NaCl的浓度为0.35mol/L。

关键词：刺五加；DNA提取；SDS法；改良

基金项目：吉林农业科技学院青年基金资助项目60吉农院合字[2013]第224号

中图分类号： G633.91 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.21.029

分子水平研究的关键在于植物基因组DNA的质量好坏，它直接会影响到后续工作的成功与否[1]。本文主要通过对SDS法基因组提取方法针对性改良，最终探索出适合于刺五加的基因组最佳提取方案，意在为相关科研工作者在刺五加DNA分析等分子水平上的研究提供一定的参考和技术支持。

1 试验材料与方法

1.1材 料

刺五加材料选取于吉林市左家镇。

1.2 试验方法

1.2.1 传统的SDS法 参考梁雪莲等[2]的提取方法 研磨-水浴-冰浴-去蛋白-沉淀-去RNA-缓冲液溶解备用。

1.2.2 单因素试验 选出影响最大的三个因素对其改良。分别为：NaAc的浓度、SDS的含量、SDS提取液中NaCl的浓度，它们的水平表，如表1-1至表1-3。

1.2.3正交试验 根据单因素试验，确定三个水平进行L9（33）正交试验（表1-4）。

1.2.4 质量与纯度检测 琼脂糖凝胶电泳检测。

取2μl的DNA样品在1%琼脂凝胶上电泳，最高电压不超过5V/cm，当溴酚蓝染料移动到距离凝胶前沿约1厘米处时，关闭电源，停止电泳[3]。取出凝胶，打开紫外灯，放入凝胶成像系统中观察、拍照并分析结果。

超微量紫外分光光度计检测。

以OD260/OD280的比值作为判断提取DNA的纯度。

取2μLDNA样本滴加在超微量紫外分光光度计Bionano上，测定在260nm和280nm紫外光波长下的吸光度值。

纯净的核酸溶液OD260/OD280在1.8～2.0之间，比值小于1.8，说明蛋白质未脱净；比值大于2.0，说明有RNA污染。

根据浓度可以算出DNA的得率。

2 结果与分析

2.1 质量与纯度检测结果

琼脂糖凝胶电泳结果。DNA电泳结果（图2-1）表明，传统的SDS法所得的DNA量少，有拖尾，点样孔明亮有蛋白质污染。优化后的SDS法提取的DNA量较多，条带明亮且拖尾现象不明显，降解少。

1 2 3 4

图2-1 两种方法所提取的DNA电泳图

注：1、2泳道：优化后的SDS法提取的DNA；3、4泳道：传统的SDS法提取的DNA。

超微量紫外分光光度计检测结果：

超微量紫外分光光度计检测DNA结果见表2-1。利用传统的SDS法提取所得的OD260/OD280在1.456，表明提取的样品DNA中存在一定的蛋白质及酚类物质的污染，导致比值下降。优化的SDS法提取DNA的OD260/OD280在1.817，表明蛋白质、酚类的污染明显降低。因此，优化的不管从浓度、纯度还是从得率看都好于传统的SDS法。

表2-1 传统的SDS法和优化的SDS法提取的DNA的各值的比较

2.2 单因素试验结果与分析

以传统SDS法基因组提取方法为基础，进行单因素试验，用超微量紫外分光光度计检测结果如下：

SDS含量的单因素试验

如图（2-2），据图可知，随着SDS含量的增加，OD260/OD280的值呈上升趋势，到SDS的含量为3.00%时，OD260/OD280下降。其中在1.5%～2.5%区段时OD比值也接近于1.80，故最佳SDS含量范围在1.5%～2.5%。

图2-2 SDS含量对刺五加DNA提取的影响

NaAc浓度的单因素试验

如图（2-3），据图可知，随着NaAc浓度的升高，OD260/OD280的比值在不断增加，在NaAc的浓度为2.5mol/L时，OD260/OD280值达到最高点。其中2～3mol/L区段时OD比值接近于1.80，故最佳浓度范围为2～3mol/L。

图2-3 NaAc的浓度对刺五加DNA提取的影响

SDS提取液中Nacl浓度的单因素试验

如图（2-4），据图可知，随着SDS提取液中NaCl浓度的不断上升，OD260/OD280的值也在不断上升，在0.25～0.35区段OD260/OD280三个值基本持平，比值接近于1.80，故最佳浓度范围为0.25～0.35mol/L。

2.3 正交试验结果与分析

根据单因素试验，确定3个水平进行L9（33）正交试验（表3-2）

表2-2 L9（33）SDS正交试验方案及试验结果分析

正交试验结果分析：3个因素对提取效果的影响顺序依次为A>C>B，所得的最优方案为A2B3C3即NaAc的浓度为2.5mol/L，SDS的含量为2.5%，SDS提取液中NaCl的浓度为0.35mol/L。

3结论

本试验研究了刺五加基因组SDS法最佳的提取工艺，通过单因素和正交试验，确定了最佳SDS法优化方案为NaAc的浓度为2.5mol/L，SDS的含量为2.5%，SDS提取液中NaCl的浓度为0.35mol/L。此方法获得的刺五加基因组OD260/OD280为1.817，提取的DNA颜色洁白，无褐变现象，溶于TE液后溶液无色透明DNA颜色洁白。琼脂糖凝胶电泳图也显示出条带清晰，无明显拖尾，降解少，可以获得高质量的刺五加基因组，得率也比较高，达到6.138ng/mg浓度为102.3ng/μL。

参考文献

[1]崔艳红，李晶.金丝桃属植物研究进展及黑龙江省的资源概况[J].东北农业大学学报2006，37（01）：105-110.

[2] 梁雪莲，郑奕雄，陈晓玲，曾锦姬.花生DNA提取方法比较[J].生物技术，2007，1（17）：41-43.

[3]姜建萍，田辉崔健，封毅.鸡血藤DNA提取方法的研究[J].安徽农业科学2012，40（26）： 782-783.

[4]马育轩，王艳丽，周海纯，等.乌腺金丝桃的化学成分及药理作用研究进展[J].中医药学报，2012，40（06）：125-126.

[5]李骥，等.乌腺金丝桃抗心律失常作用的研究[J].中医药信息，2008，25（06）：32-33.

[6]李冀，石鑫，高彦宇，等.乌腺金丝桃抗抑郁作用的药理研究[J].中医药信息，2012，29（02）：16-17.

[7]梁雪莲，郑奕雄，陈晓玲，曾锦姬.花生DNA提取方法比较[J].生物技术，2007，1（17）：41-43.

[8]杨丽，张俊环，孙浩元，王玉柱.基于改良SDS法的杏基因组DNA提取[J].中国农学通报，2008，24（04）：69-72.

作者简介：杨祥波，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：生物技术。