穿心莲内酯对SD大鼠大脑中动脉栓塞模型NMDA受体的影响
【摘 要】目的：研究穿心莲内酯对SD大鼠大脑中动脉栓塞模型损伤后NMDA受体NR2B亚基表达以及Ser1303与Tyr1472号位点磷酸化的表达的影响。方法：建立大脑中动脉栓塞模型，术后24h给药穿心莲内酯，之后采用western blot的实验方法测量不同实验组NR2B及磷酸化的Ser1303和Tyr1472的表达情况。结果：模型组大鼠脑缺血损伤处的NR2B 亚基、磷酸化Ser1303 及Tyr1472 的表达量均较对照组升高； 在大脑中动脉栓塞术后24小时给予穿心莲内酯能够有效降低损伤侧NR2B 亚基、磷酸化Ser1303 及Tyr1472 的表达量， 穿心莲内酯对于上述各项表达量的影响不提示呈剂量依赖性，低浓度用药（0.1mg/kg）较高浓度用药（0.2mg/kg）效果较好。结论：穿心莲内酯能够有效降低大脑中动脉损伤模型中NR2B及磷酸化Ser1303及Tyr1472的水平，提示穿心莲内酯可能是通过调节脑缺血再灌注损伤后NMDA中NR2B亚基及该亚基磷酸化Ser1303和Tyr1472位点的水平，从而发挥其对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
【关键词】穿心莲内酯；大脑中动脉栓塞模型；NMDA受体；SD大鼠
【Abstract】Objective： To explore the effect of Andrographolide（ Andro） on NMDA receptor NR2B subunit and its phosphorylation sites in rat middle cerebral artery occlusion （ MCAO） model. Method： We first established rat MCAO model，and treated SD-rats with Andro by intraperitoneal injection pre and after the MCAO operation，we measured the expression of NR2B subunit and phosphorylation of NR2B subunit at Ser1303 and Tyr1472 sites by using Western blot.Results：The results of Western blot analysis indicated that the expression of NR2B subunit and the phosphorylation of NR2B subunit at Ser1303 and Tyr1472 in MCAO group remarkably increased，compared with sham operation group； Additionally，treated with Andro after MCAO operation，the expression of NR2B subunit and the phosphorylation of NR2B subunit at Ser1303 and Tyr1472 both decreased remarkably. Conclusion： Andro can reduce the expression of NR2B subunit and its phosphorylation level effectively in MCAO model，which suggests that decreasing the level of NR2B subunit and its phosphorylation level after ischemia injury may contribute to the neuroprotective mechanisms of Andro.
【Key words】 Andrographolide（ Andro）；MCAO； NMDA receptor； phosphorylation； rat
腦卒中是一种急性脑血管疾病，是由于血管阻塞导致血液不能流入或脑部血管突然破裂而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。脑卒中是由生活方式、环境、遗传等因素共同导致的疾病、研究显示，脑卒中的主要危险因素包括：高血压、糖尿病、血脂异常、心脏病、超重与肥胖、颈动脉狭窄、体力活动不足、吸烟、酗酒、空气污染、卒中家族史等。“全球疾病负担研究2013”显示，中国是全球可控制卒中危险因素占比例比较高的国家之一，约94%的脑卒中负担由可控制危险因素造成。中国脑卒中危险因素种类众多，人群数量庞大，高危人群比例较高，已呈爆发式增长态势，更积极地防治脑卒中刻不容缓[1]。实验证明，神经细胞在完全缺血、缺氧十几秒后即出现电位变化，20-30秒后大脑皮质的生物电活动消失，30-90秒后小脑及延髓的生物电活动也消失。脑动脉血流中断持续5分钟，神经细胞就会发生不可逆性损害，出现脑梗死。上述变化是一个复杂的过程，称为缺血性级联反应。严重缺血的脑组织能量很快耗竭，导致能量依赖性神经细胞膜的泵功能衰竭。脑缺血引起膜去极化和突触前兴奋性递质（主要是谷氨酸和天门冬氨酸）的大量释放，细胞外液中的钙离子通过电压门控通道和NMDA受体门控通道进入细胞内，加上细胞内存在ATP供应不足和乳酸酸中毒，使细胞内的结合钙大量释放，上述细胞内钙离子稳态失调在神经细胞缺血损害中起重要作用，称为细胞内钙超载。受钙离子调节的多种酶类被激活，导致膜磷脂分子和细胞骨架破坏，大量自由基生成，细胞产生不可逆性损伤[2]。
穿心莲属于爵床科植物，具有很高的药用价值，广泛应用于印度、斯里兰卡、中国及其他南亚国家。在印度，穿心莲被称为“苦味之王”[3]。在印度的传统医学中应用广泛，它主要通过：生氰作用、植物激素活化、细胞壁木质化、次级代谢产物修饰等反应对微生物和害虫的入侵发生多防御应答[3]。穿心莲在抗菌消炎、抗血栓和保肝等方面具有很强的药理作用。穿心莲代替抗生素的药理作用被用于动物模型上治疗呼吸道感染和腹泻。穿心莲提取物具有抗病毒的作用，已有研究表明它对单纯疱疹病毒1型有效[4]。在古老的阿育吠陀提到，这种植物也被用于治疗肿瘤。穿心莲内酯是穿心莲中的主要有效成分。已有研究表明，穿心莲内酯具有保护肝脏和胆囊的作用，而且疗效比已知的水飞蓟素更加显著[3]。穿心莲内酯在治疗肝脏疾病、常见的发热和咳嗽，在抗炎，抗肿瘤方面具有良好的药用价值[3、5]。穿心莲内酯在治疗过敏反应，出血性疾病，以及中枢神经系统功能障碍等疾病也有明显的疗效。在印度药典中，该药已被正式列入解热抗炎、保护肝脏与免疫刺激剂的药物范畴中[6-8]。穿心莲内酯的衍生物如穿心莲新苷等是治疗肿瘤、糖尿病、肾脏疾病、肝炎和艾滋病的潜力药物[9]。穿心莲内酯及其衍生物被称为一种新兴的抗炎抗癌药物[10]，且已被广泛用来治疗过敏，出血性病变，中枢神经系统功能障碍及其他疾病。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠75只，清洁级，体重250-300g，由北京华阜康生物科技有限公司提供，由动物室饲养员管理，喂养标准饲料并饮用纯净水，饲养环境为我院动物实验中心，每日12小时光照/12小时黑暗，恒温20～25℃。术前12h禁食。
1.1.2 仪器及试剂 穿心莲内酯，DMSO溶剂，NR2B、磷酸化Ser1303（P-1303）抗体（Abcam），磷酸化Tyr1472（P-1472）抗体（CST），MCAO线栓（广州佳灵生物技术有限公司），膜蛋白提取试剂盒（碧云天公司）。
1.1.3实验分组 Andro溶于含有1%二甲基亚砜（DMSO）生理盐水中，MCAO术后腹腔注射，Andro-L給予0.1mg/kg，Andro-H给予0.2mg/kg，注射剂量2ml/kg。
Sham组：假手术后腹腔注射等量1%DMSO；
pMCAO组：术后腹腔注射等量生理盐水；
Vehicle组：术后腹腔注射等量1%DMSO；
Andro-L组：术后腹腔注射Andro 0.1mg/kg；
Andro-H组：术后腹腔注射Andro 0.2mg/kg。
1.2 方法
1.2.1 MCAO模型制备
术前禁食12h。大鼠称重后，用10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射进行麻醉。参照Longa方法，采用线栓法制作永久性大鼠大脑中动脉闭塞（permanent middle cerebral occlusion，pMCAO）模型。具体步骤如下：大鼠麻醉成功后，仰卧固定在恒温手术台上，维持大鼠体温（37.0±0.5）℃，剪毛消毒，取正中切口3cm，剪开阔筋膜，轻轻分离右侧颈总动脉（commoncarotid artery，CCA）、颈外动脉（externalcarotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），注意保护血管周围神经，用0号缝合线颈总动脉近心端及境外动脉起始部结扎，止血夹夹颈内动脉，在CCA上作一个小切口，将直径0.24mm尼龙栓线从CCA插入ICA，栓线插入深度距CCA分叉（18.5±0.5）mm堵住MCA的开口。结扎固定栓线，缝合皮肤。假手术组模型制步骤同手术组，血管分离后不插入线栓。术中及术后用白炽灯照射动物以维持其肛温在37±1℃，直到恢复活动。各组动物手术完成后，放入洁净饲养笼中，在20～25℃恒温条件下饲养，术后自由进食水。
1.2.2神经行为学评分
大鼠在MCAO 术后24 h，依据Bederson 标准对动物进行神经行为学分级评分（ 0 ～ 4 级） 。具体如下： 0 级： 未观察到神经症状（ 0分） ； 1 级： 提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁（ 1 分） ； 2 级： 将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低（ 2 分） ； 3 级： 动物自由行走时向手术对侧环转或转圈（ 3 分） ； 4 级： 软瘫，肢体无自发活动（ 4分）
1.2.3 Western Blot
将MCAO 模型缺血处的皮层组织分离出来，用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白，并用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。按照分组，各取50 μg，用8% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，并用一抗封闭后4℃冰箱过夜，于次日以二抗封闭并以二抗体偶联物进行免疫检测，Tanon 凝胶图像处理系统对发光底物行显影，并以同一张膜上β-tubulin作为对照，用Gelpro32 凝胶分析软件分析结果。定量分析采用目的蛋白与β-tubulin 含量比值标准化蛋白含量。
统计学处理： 应用spss22.0 软件进行，统计方法采用单因素方差分析，数据均用珋x ± s 表示，当P< 0. 05 定为具有显著性差异。
2 结果
如Fig.1 所示，与假手术组相比，MCAO 模型组中的NR2B 亚基含量增加（P<0.05） ，与之前的报道一致[11]。同时，P-1303及P-1472的含量也明显高于假手术组（P<0.05），三者的变化趋势相似。在MCAO术后24h术后经腹腔注射给予穿心莲内酯，能够有效降低损伤侧NR2B亚基、P-1303及P-1472的表达量，当给药剂量为0.1mg/kg时，与MCAO组相比，NR2B亚基、P-1 303及P-1472均有明显的减少（P<0.05）； 给药量为0.2 mg /kg 时，与MCAO组相比同样存在差异（P<0.05），但不如给药量为0.1mg/kg时显著（ Fig.1）
3 讨论
穿心莲是一种草本药物，传统古方经验中适用于用于治疗感冒咳嗽、发热、咽喉炎及一些传染性疾病。近代研究发现单药穿心莲及其提取物对多种疾病都有确实疗效。研究发现穿心莲的主要有效成分是穿心莲内酯。穿心莲内酯及其衍生物已被广泛应用于多种疾病的治疗与预防中，并有研究表明其有较强的抗血小板聚集、抗血栓形成、抗炎等作用。在体外实验中，覃林花等[12]在脂多糖活化的腹膜巨噬细胞中观察到，穿心莲内酯呈浓度依赖性抑制小鼠腹腔巨噬细胞ERK2 的磷酸化，进而抑制了TNF - α的表达。但对p38、JNK 信号转导通路以及IκBα 的降解无影响，而LI 等[13]的研究表明穿心莲内酯能够抑制p38 MAPK和ERK1 /2 的活性，以及减少NF - κB 的表达，从而抑制小鼠腹膜巨噬细胞衍生的泡沫细胞形成。穿心莲内酯可通过抑制炎症因子，抑制氧化应激等途径保护缺血后脑细胞。
近年来，由于在脑缺血治疗中的潜力，NMDAR中的NR2B 亚基受到了广泛的关注。NR2B 亚基的C 末端能够与许多的胞内蛋白质相互作用，参与调控NMDAR 在细胞中的分布和转运[14]。并且其上也有多个磷酸化位点，是参与磷酸化调节的主要区域[15]。
其中，Ser1303 被认为与脑缺血密切相关，它能够被细胞死亡相关因子DAPK1 磷酸化，从而增大NMDAR 的开放，促进Ca2 + 的内流，参与缺血后神经元的损伤甚至死亡。此外，C 末端中的Tyr1472 磷酸化，可以抑制NMDAR 的内化，使在胞膜上表达的NMDAR 相对增多。这是由于NR2B 亚基C 末端的胞内区，含有一个与NMDAR 内化相关的区域，被称为YEKL，它可以直接与内化蛋白AP-2 相连，促进NMDAR 转移到内质网上，而在此区域内的Tyr1472 位点的磷酸化与否正是影响YEKL 与AP-2 相互作用的决定性因素[16]。
本实验中采用的MCAO 模型，能够有效的重现脑血管病中的病理生理过程，从而切实地反应脑缺血再灌注过程中神经元NMDAR 的变化。在实验中我们观察到NR2B 亚基表达量、Ser1303 及Tyr1472位点的磷酸化与脑缺血再灌注损伤相关，在MCAO模型中其含量明显增加，与前人的报道一致，而穿心莲内酯能降低MCAO 模型中NR2B 及其磷酸化位点的水平，故本實验研究表明，穿心莲内酯对脑缺血的保护作用可能是通过降低脑缺血后NR2B 表达及其磷酸化改变来实现的。
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