0HPLC法测定五维赖氨酸颗粒中维生素B1、维生素B2、维生素B6的含量
[摘要] 目的 建立HPLC法测定五维赖氨酸颗粒中维生素B1、维生素B2、维生素B6含量的方法。方法 采用高效液相色谱法；色谱柱为Agela-C18；流动相：三乙胺-冰醋酸-甲醇-8 mmol/L己烷磺酸钠溶液（0.2：7.5：220：775）；检测波长280 nm；流速1.0 mL/min。结果 维生素B1、维生素B2、维生素B6分别在0.622 9～7.474 8 μg（r=1.000）、0.087 7～1.052 9 μg（r=1.000）、0.041 45～0.497 4 μg（r=1.000）范围内，线性关系良好，平均回收率分别为100.2%（RSD：0.3%）、100.9%（RSD：0.5%）、98.6%（RSD：1.8%）。结论 该方法简便，准确，可用于五维赖氨酸颗粒的含量测定。
[关键词] 高效液相色谱；五维赖氨酸颗粒；含量测定
[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2015）10（b）-0140-03
Determination of vitamin B1 、vitamin B2、vitamin B6 in Five Vitamins and Lysine Granules by HPLC
SUN Jing-jing1，SUN Jia-ling1，SUN Qiu2
Jilin Provincial Institute for Drug Control，Changchun，Jilin Province，130033 China；2.Baicheng Institute for Food and Drug Control，Baicheng，Jilin Province，137000 China
[Abstract] Objective To establish an HPLC method for determination of vitamin B1、vitamin B2、vitamin B6 in Five Vitamins and Lysine Granules. Methods HPLC was performed on an Agela-C18 column ， and the mobile phase was the mixture of triethylamine-glacial acetic acid- methanol-8 mmol/Lsodium hexanesulfonate solution（0.2：7.5：220：775）at a flow rate of 1.0 mL/min；The detective wavelength was 280nm. Results The calibration curve of vitamin B1、vitamin B2、vitamin B6 respectively was in good linearity over the range of 0.6229-7.4748 μg（r=1.000）、0.0877-1.0529 μg（r=1.000）、0.04145-0.4974 μg（r=1.000）and the average recovery was 100.2%（RSD：0.3%）、100.9%（RSD：0.5%）、98.6%（RSD：1.8%）. Conclusion The method is simple，accurate，and can be used for the determination of vitamin B1、vitamin B2、vitamin B6 in Five Vitamins and Lysine Granules.
[Key words] HPLC；Five Vitamins and Lysine Granules；Content
五维赖氨酸颗粒是由盐酸赖氨酸、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙组成的复方制剂，用于促进小儿、儿童正常发育及年老体弱者的营养补充。国内现有两家生产企业，延边大学草仙药业有限公司仅添加了蔗糖一种辅料，南京厚生药业有限公司添加的辅料种类较多，有甘露醇、蔗糖、健康糖、橘子香精和聚乙烯吡咯烷酮等。现行标准收载于国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第七册[1]，仅对盐酸赖氨酸的含量进行测定，未对其他组分进行测定。由于五维赖氨酸颗粒主成分含量低且一家企业的辅料种类复杂，按照文献[2]中的含量测定方法各组分无法达到基线分离，不能用于各组分的含量测定。因此，本试验改进建立了高效液相色谱法同时测定维生素B1、维生素B2、维生素B6的含量，该方法准确可靠、重复性好、专属性强，适用范围广，有利于更好地控制药品质量。
1 仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪（Agilent chemStation色谱工作站）；岛津UV-1700紫外-可见分光光度计；THZ-82型恒温水浴振荡器。
五维赖氨酸颗粒（批号：110108，120426，120427， 120428；批号：111004、120105）；维生素B1对照品批号：100390-200301，维生素B2对照品批号：100369-200301，含量：98.7%，维生素B6对照品批号：100116-200502，均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、冰醋酸、三乙胺为色谱纯，水为超纯水；其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Agela- C18 （5.0 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：三乙胺-冰醋酸-甲醇-8 mmol/L己烷磺酸钠溶液（0.2：7.5：220：775）；流速1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。
在上述色谱条件下，供试品色谱图中有与维生素B1、维生素B2、维生素B6对照品峰保留时间一致的色谱峰，且与其它相邻色谱峰的分离良好。空白样品在维生素B1、维生素B2、维生素B6保留时间处无色谱峰，不存在干扰，见图1。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取维生素B1、维生素B2、维生素B6对照品适量，加水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）混合溶液适量，置70 ℃水浴中振荡1 h，冷却至室温，并定量稀释制成每1 mL中含维生素B10.12 mg、维生素B215 μg及维生素B67.5 μg的混合溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液 取本品10袋内容物，研细，精密称取约5 g，置50 mL量瓶中，加水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）混合溶液适量，使溶解后，置70 ℃水浴中振荡1 h，冷却至室温，加上述混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例并以相同工艺制备不含维生素B1、维生素B2、维生素B6的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。
2.3 线性关系的考察
分别精密吸取对照品溶液5、10、15、20、25、30、35、40、60 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得维生素B1、维生素B2、维生素B6的回归方程分别为y=7.551 3+1 025.40x，r=1.000；y=6.380 4+3 727.28x，r=1.000；y=6.064 5+2 060.50x，r=1.000。表明维生素B1、维生素B2、维生素B6进样量分别在0.622 9～7.474 8 μg、0.087 7～1.052 9 μg、0.041 45～0.497 4 μg范围内，与峰面积均呈良好的线性关系。
2.4精密度试验
取同一批样品（延边草仙药业，批号：110108）制备的供试品溶液，连续进样6次，每次进样20 μL，记录峰面积，结果维生素B1、维生素B2、维生素B6的峰面积RSD分别为0.1%、0.7%、0.4%。表明仪器精密度良好。
2.5 重复性试验
取同一批样品（延边草仙药业，批号：110108），制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样，结果维生素B1、维生素B2、维生素B6的平均含量分别为1.112 mg/g、0.139 mg/g、0.074 5 mg/g，RSD分别为0.1%、0.7%、2.2%，表明该方法重复性较好。
2.6 稳定性试验
取“2.4”项下的溶液，分别在配制后0，2，4，8，12，16，20， 24 h，按上述色谱条件进样，结果维生素B1、维生素B2、维生素B6的峰面积RSD分别为0.2%、0.6%、0.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 回收率测定
取本品细粉（批号：110108，维生素B1、维生素B2、维生素B6含量分别为1.112 mg/g、0.139 mg/g、0.074 5 mg/g）2.5 g，共9份，精密称定，分别置50 mL量瓶中，分别精密加入维生素B1对照品溶液（浓度为0.622 9 mg/mL）4 mL、5 mL、6 mL，维生素B2对照品溶液（浓度为0.087 74 mg/mL）4 mL、5 mL、6 mL，维生素B6对照品溶液（浓度为0.082 9 mg/mL）2 mL、2.5 mL、3 mL，加水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）混合溶液适量，振摇使溶解，置70℃水浴中振荡1 h，冷却至室温，加水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果，结果维生素B1、维生素B2、维生素B6的平均回收率依次为100.2%，100.9%，98.6%，RSD依次为0.3%，0.5%，1.8%（n=9）。
2.8 样品测定
取收集到的6批样品，按所述方法测定维生素B1、维生素B2、维生素B6含量，结果见表1。
3 讨论
3.1 检测波长的选择
分别维生素B1、维生素B2、维生素B6对照品的水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）溶液适量，适当稀释，经UV-1700紫外-可见分光光度计在波长200～600 nm范围内测定其紫外吸收光谱，测得维生素B1 在246.7 nm、维生素B2在445.6 nm和266.5 nm、维生素B6在291 nm的波长处有最大吸收。由于维生素B6在三组分中含量最低，为保证各组分均有适当的响应值，同时参考有关文献[3]，选择280 nm为检测波长。
3.2 流动相的选择
参考有关文献[4-5]，考察了以下3种流动相系统：①三乙胺-冰醋酸-甲醇-0.008 mol/L己烷磺酸钠（0.2：7.5：220：775）；②0.05 mol/L磷酸二氢钾-水-乙腈-甲醇（0.5：79.5：5：15）；③庚烷磺酸钠溶液（取庚烷磺酸钠0.6 g，1000 mL水溶解，加三乙胺2.8 mL，用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（体积比6∶1）；④醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）-甲醇（65∶35）。经试验：流动相①维生素B1、维生素B2、维生素B6三组分分离度较好，杂质峰无干扰；流动相②、④维生素B6峰前后均存在杂质干扰；流动相③也能使三组分有效分离，但配制过程较为复杂，且维生素B1、维生素B2保留时间过长，峰形不好。故选择流动相系统①，同时测定维生素B1、维生素B2、维生素B6的含量。
3.3提取溶剂、提取条件及操作条件的选择
由于维生素B1、维生素B2、维生素B6均为水溶性维生素，同时考虑到维生素B2的稳定性，并参考相关文献，考察水、水-冰醋酸（99：1）、水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）3种溶剂在70 ℃水浴中振荡加热和100 ℃水浴中时时振摇的提取效果，结果表明以水为提取溶剂提取不完全；以水-冰醋酸（99：1）为提取溶剂，70 ℃水浴中振荡加热提取不完全，100 ℃水浴中振荡加热杂质量较高，干扰测定；以水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）为提取溶剂，在70 ℃水浴中振荡加热1 h的提取效果最好，且杂质较少；由于维生素B2具有遇光不稳定性，故操作过程中需要避光操作。
[参考文献]
[1] （国家药品标准）化学药品地方标准上升国家标准第七册.五维赖氨酸颗粒[S].2002（7）：23.
[2] 刘敏，李玉兰.HPLC法测定五维赖氨酸颗粒中四种维生素的含量[J].中国药事，2006，9（7）：593-595.
[3] 李锋武，刘鹏鸣，黄洁，等.HPLC法测定八维钙锌片中烟酰胺、维生素B1、B2、B6的含量[J].药物分析杂志，2011，31（6）：1150-1152.
[4] 王琛，陈彬彬，邹梅娟，等.HPLC法同时测定多维元素胶囊中烟酰胺、维生素B6、维生素B1和维生素B2的含量[J].海峡药学，2010，22（3）：52-55.
[5] 韩秀梅，祖述春.HPLC法测定复合维生素B片中维生素B1、B2、B6的含量[J].中国药事，2012，26（8）：891-894.
（收稿日期：2015-07-18）
