杂色曲霉素双抗夹心ELISA检测方法的建立
摘要：杂色曲霉素在自然界广泛存在，毒性强，可经过多种途径吸收，诱发人和动物产生肿瘤，从而造成极大危害，研究发现肝癌、胃癌高发区的粮食中杂色曲霉素的检出量及检出率明显高于上述肿瘤低发区。本研究旨在寻找快速简单的方法检测谷物饲料中的杂色曲霉素，通过传统小鼠单克隆抗体和噬菌体库抗体的制备，建立检测谷物中杂色曲霉素的酶联免疫吸附测定方法enzyme link immuno sorbent assays（ELISA）。
关键词：杂色曲霉素；酶联免疫吸附试验
基金项目：浙江省台州市科技项目“谷物霉菌毒素的ELISA检测技术研究及试剂盒开发应用”（20111ZD05）
中图分类号： TS210.7 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.07.031
杂色曲霉素（Sterigmatocys简称 ST）是一种杂环化合物，在自然界广泛存在，毒性强，可经过多种途径吸收，诱发人和动物产生肿瘤，从而造成极大危害。要减少其对人畜的影响，有效而快速的检测出食物及饲料中的 ST就显得非常重要。通过传统小鼠单克隆抗体和噬菌体库抗体的制备，建立检测谷物中杂色曲霉素的酶联免疫吸附测定方法enzyme link immuno sorbent assays（ELISA），有助于推动我国杂色曲霉素的监测及研究工作的开展。
1 材料
1.1试剂
抗杂色曲霉素ASH抗体（1毫克/毫升）、抗杂色曲霉素ASP1抗体（毫克/毫升）、（HRP）辣根过氧化物酶（HRP）、4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺脂钠盐（sulfo-SMCC）、Sephadex G25、磷酸盐缓冲液（PBS）、BSA、ST、NaBH4。其中抗杂色曲霉素ASH抗体和抗杂色曲霉素ASP1抗体委托北京华肽先锋生物科技有限公司生产（合同号HTXF2012030201BJ），抗杂色曲霉素ASH抗体系传统小鼠单克隆抗体制备所得，抗杂色曲霉素ASP1抗体通过噬菌体库筛选得到的ScFv抗体。其余试剂均为市购。
1.2 设备
酶标分析仪 ASCENT 354型，洗板机 BIO-RAD 1575型。
2方法
2.1 抗杂色曲霉素ASP1 抗体与辣根过氧化物酶的偶联
将纯化好的ASP1抗体进行0.01M PBS透析去除所有可能的含有NH3的物质，比如TRIS碱等，3M NaOH调节pH值7左右。
按Sulfo-SMCC说明书，用纯水溶解sulfo-SMCC，ASP1抗体与Sulfo-SMCC=1∶100的比例，在搅拌下把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入ASP1 抗体溶液中，室温搅拌30分钟以上。
用平衡缓冲液平衡Sephadex G25柱30分钟，把反应好的sulfo-smcc/ASP1 抗体混合液过柱，用紫外检测仪器收集蛋白偶联物最高峰，已去除游离的sulfo-smcc。
取与ASP1抗体等量的HRP用PBS溶解，然后在搅拌的情况下，缓解加入到ASP1+ Sulfo-SMCC复合物中，室温反应2小时以上。
通过分子筛层析去掉，未偶联的HRP和ASP1+Sulfo-SM
CC，最终得到彻底偶联在一起的HRP-Sulfo-SMCC-ASPI复合物。
将标记的抗体添加20%～50%甘油于-20℃保存。
2.2 检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒组装
检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒包括：抗杂色曲霉素ASH抗体、HRP标记的抗杂色曲霉素ASP1抗体（HRP-Sulfo-SMCC-ASP1）、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品ST（100微克/毫升，0.1毫升）、阴性对照样品BSA。辣根过氧化物酶底物缓冲液：称取10毫克 四甲基联苯胺（TMB）溶于5毫升无水乙醇中制备成TMB贮存液。待使用时取0.5毫升 TMB贮存液加到10毫升磷酸柠檬酸底物缓冲液（0.2M Na2HPO4，0.1M柠檬酸）中，再加入32微升 0.75%H2O2混匀，配置成辣根过氧化物酶底物缓冲液。
2.3 检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒的使用方法
将抗杂色曲霉素ASH抗体（1毫克/毫升）用包被液（PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）按1∶320稀释，取稀释后的ASH抗体稀释液，加入酶标板中，每孔100微升，4℃过夜；
洗涤液（pH7.4PBS）清洗酶标板3次，每次在摇床上摇5～8分钟；
将100μ1待测样品加入到包被的酶标板中，37℃孵育2小时，每个样品包被2个孔，同时将标准品进行梯度稀释依次为5pg/μl、10pg/μl、15pg/μl、20pg/μl、25pg/μl、30pg/μl，每孔100μl；
将辣根过氧化物酶标记的抗杂色曲霉素ASP1抗体（HRP-Sulfo-SMCC-ASP1）100μ1按1∶3000～1∶5000稀释，每孔100μ，37℃孵育2小时；
再用洗涤液清洗3次，加辣根过氧化物酶底物缓冲液100μ1，显色5分钟后，加入终止液100μ1，终止显色；
用酶标仪检测OD450的值，依据标准品的吸光值制备标准曲线，从而根据吸光值判断所测样品中ST的浓度。
2.4检测杂色曲霉素的ELISA检测试剂盒的灵敏度测试
通过标准品检测所制备的ELISA试剂盒的灵敏度，标准品ST的稀释度如下：500pg/μl、250pg/μl、125pg/μl、62.5pg/μl、
31.25pg/μl、15.625pg/μl、7.8125pg/μl、3.90625pg/μl、
1.953125pg/μl、0.9765625pg/μl、0.4882812pg/μl、0.2441406
pg/μl，按ELISA步骤如2.3所述，经过测试该试剂盒能检测的最低量为10pg/μl。
2.5检测杂色曲霉素的ELISA检测试剂盒的特异性分析
用黄曲霉毒素M1（Aflatoxins M1，AFM1）1ng/μ1、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）1ng/μ1、杂色曲霉素阳性样品作为模拟待检标本，按ELISA步骤如2.3所述，ELISA试剂盒能特异性检出杂色曲霉素阳性样品，并且只能特异性的与ST结合，与黄曲霉毒素M1（AFM1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）无交叉反应。
3 结论
传统小鼠单克隆抗体与噬菌体抗体库的技术相结合的方法，使双抗夹心ELISA方法更加灵敏，能达到检测的最低量为10pg/μl。噬菌体抗体相对传统小鼠单抗的制备工艺更加简单，使整个ELISA检测数据更加稳定，更加方便快捷，传统单抗作为第一抗体包被在ELISA 板上，充分发挥传统单抗捕捉抗原的能力。
ST毒素ELISA检测技术与传统的色谱、质谱等方法相比所需设备简单，ELISA方法仅需一台酶标仪或者不需要检测设备，加样后直接进行肉眼观察判定即可。前处理程序简化，不需要净化。检验快速，检测容量大，检验成本低。由于方法简单易行，不需特殊设备，故可在生产现场进行检测。谷物可经过抽提、浓缩并重新溶于水溶液中即可取样检测 。其检验操作可在几分钟至几小时内完成。检测容量根据所用固相的不同，每次可同时分析几十个甚至更多样品。
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作者简介：江飞剑，本科学历，台州出入境检验检疫局，兽医师，研究方向：饲料安全。
