高效液相色谱法测定醋溴茶碱原料药的含量
【摘 要】目的：采用高效液相色谱法测定醋溴茶碱原料药的含量。方法：以Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），乙腈-磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钾4.5g、四丁基硫酸氢铵2.5g，加水使溶解并稀释至1000mL，再加甲酸5mL，用氢氧化钠溶液调节pH值至2.8）（15：85，V/V）为流动相，流速0.8 mL/min，柱温25℃，检测波长248nm。结果：在该色谱条件下，醋溴茶碱在0.3～0.5 mg/mL浓度范围内呈良好线性关系，Y=11907700X-67003.1，r=0.99988，平均回收率为100.24% （RSD=0.15%）。结论：该方法灵敏、准确、回收率高、简便，可用于醋溴茶碱原料药的含量测定。
【关键词】高效液相色谱法；醋溴茶碱；含量测定
【Abstract】Objective：To establish a HPLC method for the determination of the content of acebrophylline bulk drug.Methods： The separation and analysis was performed on a Agilent Zorbax SB-C18 column（150mm×4.6mm， 5μm），the mobile phase consisted of acetonitrile - phosphate buffer solution（Took dipotassium phosphate5.0g、tetrabutylammonium hydrogensulfate 3.0 g，Added water to dissolve and dilution to 1000 mL，Added formic acid 5 mL， Adjusted pH value to 3.0 with Sodium hydroxide solution） （10：90），the flow rate was 1.0mL/min，the column temperature was 25℃，the detection wavelength was set at 248nm. Results： A good linear relationship was obtainted in the range of 0.3～0.5mg/mL，Y=11907700X-67003.1，r=0.99988，The average recovery rate was 100.24%（RSD=0.15%）.Conclusion ：The method is sensitive、accurate、simple and suitable for the quantitative control of acebrophylline bulk drug.
【Key words】HPLC；acebrophylline；Content Determination
1 引言
国内外研究表明，气道粘液和缺乏表面活性剂有着因果关系：通过刺激磷脂合成粘液[1，2]，并刺激呼吸系统炎症性因子从而导致鼻粘膜炎症反应和呼吸系统的疾病，特别是与慢性阻塞性肺疾病有很紧密的联系[3]。醋溴茶碱是一种具有显著促进排痰、改善呼吸状况、抑制合成。释放炎症介质，有支气管扩张活性，以及粘液溶解活性。可以用于治疗急性慢性呼吸道疾病。是一种具有明显的抗炎能力的新型药物，醋溴茶碱同时也限制了感染慢性阻塞性肺部疾病患者的复发频率[4]。1992年由辉瑞公司（Pfizer）以商品名Surfolase首次上市，主要应用于急、慢性支气管炎、气喘、副鼻腔炎等气道衰竭性障碍及粘液分泌障碍的急慢性呼吸道疾病[5]，目前国内醋溴茶碱有关研究还相对较少[6]。 本文采用高效液相色谱法[8]测定其含量，获得了较满意的结果，现报道如下。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
LC一20l0A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Sartorius BS224S型天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；醋溴茶碱（批号140101，140102，140103）、醋溴茶碱对照品（批号131201，纯度99.7%）和乙酸茶碱（批号：131201）均由贵州百灵药业有限公司提供；盐酸氨溴索（批号：Y037-0907011）由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；其余試剂均为分析纯。实验用水为蒸馏水。
2.2 实验方法
2.2.1 色谱条件与系统适用性
色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，150mm×4.6mm ，5μm；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钾5.0g、四丁基硫酸氢铵3.0g，加水使溶解并稀释至1000mL，再加甲酸5mL，用氢氧化钠溶液调节pH值至3.0）（10：90，V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：248nm；进样量：10μL。在上述色谱条件下进样，分别测得空白溶剂、对照品和样品色谱图，见图l所示。结果显示，乙酸茶碱、氨溴索[7] （醋溴茶碱为复合盐，色谱检测中出现2个色谱峰）依次出峰，且样品溶液两主峰保留时间与对照品溶液两主峰保留时间一致，理论塔板数按乙酸茶碱峰及氨溴索峰计算均不低于5000，各杂质峰和两主峰的分离度符合规定。
（a）
（b）
图1 对照品（a）含量色谱图 样品（b）含量色谱图
Fig.1The chromalograms of reference substance（a） and sample （b）
2.2.2 对照品溶液的制备
取醋溴茶碱对照品约20mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备
取供试品约20mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3 结果与讨论
3.1 专属性试验
取空白溶剂10μL直接进样，记录色谱图。由色谱图（见图1）可见，溶剂对醋溴茶碱含量检测无干扰。
3.2 线性关系
精密称取本品对照品80.22mg，置50mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，分别精密量取该溶液各4.0mL、4.5mL、5.0mL、5.5mL、6.0mL（相当于对照品溶液浓度的80%、90%、100%、110%、120%），分别置于20mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，按浓度从低到高的顺序依次取10μL进样，记录色谱图，以乙酸茶碱和氨溴索两主峰面积之和（Y）对浓度（X）进行线性回归分析，得方程Y=11907700X- 67003.1，r=0.99988。结果表明：醋溴茶碱在0.3mg/mL～0.5mg/mL浓度范围内，两主峰色谱峰面积之和（Y）与浓度（ X） 呈良好的线性关系。
3.3 检测限
分别精密称取茶碱乙酸（批号：140101）和盐酸氨溴索（批号：131201）适量加流动相使溶解并稀释制得储备液；逐级稀释至茶碱乙酸浓度为1.2285×10-7g/mL，氨溴索的浓度8.835×10-8g/mL进样10μL，测定色谱系统基线。按信噪比为3，测得茶碱乙酸的检测限浓度为0.9225×10-7g/mL，氨溴索的检测限浓度为7.568×10-8g/mL。
3.4 系统适用性
取本品对照品约20mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，取该溶液10μL进样，重复进样6针，记录色谱图，计算乙酸茶碱和氨溴索峰面积的RSD分别为0.04%和0.05%，表明该溶液进样精密度良好。
3.5 稳定性试验
取本品对照品适量，加流动相使溶解并制成每1mL约含醋溴茶碱400μg的溶液，分别在0、6、12、24小时进样10μL。结果显示：乙酸茶碱峰面积RSD=0.3%，氨溴索峰面积RSD=0.1%，两主峰面积之和RSD=0.2%，表明该溶液在24小时内稳定性良好。
3.6 回收率试验
精密称取醋溴茶碱供试品约20mg，精密称定，置100mL量瓶中， 平行称量9份；精密称取本品对照品80.22mg，置50mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，分别精密量取该溶液各7.5mL、12.5mL、17.5mL（相当于对照品溶液浓度的30%、50%、70%、）各3份，分别置于装有供试品的100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定峰面积。按标准曲线计算回收率。结果低、中、高3种浓度溶液的回收率为100.24%（见表1）。
3.7 样品含量测定
取三批醋溴茶碱样品（批号：140101、 140102、140103）按2.2项下溶液的制备和色谱条件进样，记录色谱图，按外标法计算样品的含量，结果见表2.
3.8 讨论
3.8.1 流动相的选择
按2015年版中国药典盐酸氨溴索质量标准中有关物质测定的色谱条件，采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，以乙腈-0.01mol/L磷酸氢二铵（用磷酸调节pH值为7.0）（50：50）为流动相。经试验，乙酸茶碱出峰太早，与溶剂峰重叠，且未检出杂质。
采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钾5.0g、四丁基硫酸氢铵3.0g，加水使溶解并稀释至1000mL，再加入甲酸5mL，用氢氧化钠溶液调节pH值至3.0）（10：90）为流动相。经试验，乙酸茶碱和氨溴索峰型好，且乙酸茶碱与溶剂峰分开，共检测到2个杂质，且各物质间分离度符合要求。故选择后者为流动相进行试验。
3.8.2 色谱柱的选择
分别选用Inertsil ODS-2色谱柱 和Agilent Zorbax SB-C18色谱柱对本品进行检测，结果表明采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱主峰峰型更好且保留时间更佳。故选择Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱。
3.8.3 检测波长的选择
取本品适量，加稀释剂溶解后进样，在本流动相中的紫外吸收光谱图及三维液相色谱图显示，茶碱乙酸在272nm的波长处有最大吸收、氨溴索在248nm的波长处有最大吸收；比较272nm及248nm波长处的色谱图，在272nm的波长处氨溴索峰的峰响应太低，两个主峰响应相差太大；在248nm的波长处两个主峰响应相当。且在272nm和248nm的波长下均能检测到2个杂质，故选择248nm作为本品的检测波长。
3.8.4 柱温的选择
我们选择柱温为25℃、35℃对样品进行分析，结果表明：除保留时间有细微变化外，检出杂质个数、水平及总杂质水平均基本一致。故选择常用温度25℃对样品进行分析。
4 结论
本方法分离度好，灵敏度高，结果准确，克服了乙酸茶碱和溶剂峰难分离的难题，为醋溴茶碱原料药的质量控制提供了一定的科学依据。
参考文献：
[1] Von Seefeld H， Weiss JM， Rensch H， et al. NeueKonzepte in dertherapie dur Mukostase. Prax KlinPneumol 1983； 37： 896.
[2] Von Seefeld H， Weiss JM， Rensch H， et al. NeueKonzepte in der therapie dur Mukostase. Prax KlinPneumol 1983； 37： 896.
[3] CatenaE， BariffiF， D’AmatoG， IodiceF. Efficaciaclinico- funzionaledell’ acebrofillina nel trattamento dipazienti conbronchite cronica asmatiforme. Giorn ItMal Tor 1992； 1 （s）： 97-102.44.
[4] Description of the Medicines for Human use （ Clinical Trials ） Regulations 2004.
[5] 王黎，等.RP.HPLC法測定醋酸溴茶碱胶囊的含量。西北大学学报（自然科学版）， 2011年8月，第4l卷第4期。
[6] 中国药典2015年版盐酸氨溴索质量标准。
[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京化工出版社，2005：34
[8] 丁晓菊，赵小丽等.高效液相色谱法同时测定厚朴温中胶囊中的7种有效成分[J].色谱，2009，27（1）：107-110
