山慈菇提取物抑制血管形成的药效学研究
摘要：本研究采用MTT法考察山慈菇提取物对人脐静脉细胞株（HUVEC）增殖的影响，并以此为依据对山慈菇提取物进行活性跟踪分离，运用鸡胚尿囊膜血管生成模型分析山慈菇提取物对新生血管的影响。山慈菇提取物具有明显的抑制HUVEC增殖活性，同时具有抑制CAM血管新生成的作用，尤以山慈菇乙酸乙酯层（氯仿—甲醇）梯度洗脱的F1B提取物活性最佳。得出提示山慈菇提取物具有明显抑制血管生成作用，有可能成为血管生成抑制剂。
关键词：山慈菇 ；提取物；抗血管生成
基金项目：吉林农业科技学院重点学科培育项目（吉农合字〔2013〕第077号）
中图分类号： R285 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.21.031
山慈菇学名Tuliraedull.s（Miq.）Baker，别名：山蛋、光菇、老鸦瓣等。分布于吉林、辽宁、安徽、浙江等地。鳞茎入药，功用主治散结、化痰、治咽喉肿痛、痈疽、疮肿、溃疡等；古代多用于治疗疮疖肿，疼腮、丹毒、咽喉肿痛等。目前也是治疗多种肿瘤的常用药，如咽喉癌、淋巴瘤、乳腺癌等。其抑制肿瘤生长的药效机制是否与其抑制肿瘤新生血管有关，国内外少见报道。因此本实验对山慈菇提取物抗血管生成的作用进行了初步研究。
1 试验材料与方法
1.1试验材料
山慈菇购自安徽毛集镇；MTT、bFGF、Retinoic acid （ Sigma公司）， MCDB-131细胞培养基（Gibco BRL公司），胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺（华美生物工程公司）， 其他试剂均为国产分析纯；受精白皮蛋购自吉林农业科技学院养鸡场；人脐静脉细胞株（HUVEC），购自上海细胞所。
1.2试验方法
1.2.1山慈菇鳞茎提取物的制备 真空干燥的山慈菇鳞茎（4公斤）粉碎后，85%乙醇回流提取3次，合并提取液得浸膏（170克），将干浸膏用水（500毫升）悬浮后，依次用正丁醇、乙酸乙酯萃取，回收溶剂得正丁醇部分（3克）、乙酸乙酯部分（45克）、水层部分（120克）。取乙酸乙酯提取物（4克）硅胶柱层析分离，氯仿—甲醇洗脱（CHCl3-MeOH，9∶1，1.5L），硅胶TLC检查合并相同组分，得（F1-F4）。取F1（830毫克），硅胶柱层析，氯仿—甲醇（20∶1，10∶1，5∶1，1∶10）梯度洗脱，硅胶TLC检查合并相同组分得（F1A，F1B，F1C）。
1.2.2药物配置 山慈菇提取物以95%乙醇溶解，配置成0.1mol/L的母液，并用0.22μmol/L的灭菌滤器过滤以灭菌。加药实验时用培养液稀释至所需浓度，并确保乙醇在培养液中的浓度不超过0.1%。
1.2.3细胞培养 将HUVEC以含10%胎牛血清的EGM-2培养基，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，第二天观察生长情况，以后每2～3天换液，细胞逐渐长满融合时传代培养，传至第三代开始用于实验。
1.2.4细胞增殖抑制实验 取对数生长期HUVEC细胞加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化使其脱壁，用细胞培养基重悬成细胞悬液；调整细胞浓度为2×104-4.0×104/毫升，以每孔密度4000～6000个活细胞接种于96孔板，每孔150ul细胞悬液，继续培养24小时；待细胞贴壁后，药物组加入50ul含不同浓度的山慈菇提取物的培养基（200ug/mL、100 ug/mL 10ug/mL、1 ug/mL；每组浓度设立3个复孔）， 并同时设立空白组及对照组，对照孔接种等量活细胞，但是不加入药物，空白孔不接种细胞，空白组和对照组只加入等量培养液，置细胞培养箱中培养48小时后，加入10ul MTT（终浓度0.5克/升）继续培养4小时后，弃培养液，按每孔200ul DMSO分别加入，微型振荡器振荡10分钟促进结晶充分溶解，在酶标仪中选择490纳米波长测定各孔吸光度（OD值）。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（对照组0D值-实验组0D值）/（对照组0D值-空白组0D值）×100%。计算药物半数抑制浓度（IC50）。
1.2.5 鸡胚绒毛尿囊膜（chick embryo choriallantoic membrane，CAM）血管形态学检测 参考文献方法等方法，制备鸡胚尿囊膜。
设置山慈菇提取物给药组、生理盐水阴性对照组、Rentinoic acid阳性对照组。甲基纤维素M20配制成0.5%浓度溶液，灭菌，制备直径为7毫米甲基纤维素膜药物载体贴于CAM的部位。其中山慈菇提取物组平行设置5个质量浓度，滴加10ul含不同浓度药物的生理盐水溶液于甲基纤维素膜上（终浓度分别12.5ug/ml、25 ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml 的山慈菇醇提物），同时以不含药物的生理盐水为阴性对照组， Rentinoic acid（10ul、100ug/ml）为阳性对照组，每组10个鸡胚，将无菌贴膜封闭窗口，于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中继续孵育，孵育72小时后即可观察到药物载体周围新生血管生长情况。山慈菇提取物对鸡胚尿囊膜新生血管抑制率：药物新生血管抑制率=（生理盐水组新生血管数-药物组新生血管数） / （生理盐水组新生血管数）×100%。
1.2.6统计学处理 实验数据均用（ X±s）表示，采用spss 17.0统计软件进行分析。
2结果与分析
2.1 山慈菇提取物对HUVEC增殖的抑制活性测定
采用活性跟踪法对山慈菇进行活性跟踪提取分离，测试提取分离过程中不同萃取段或分离段对HUVEC增殖的抑制作用，每次选取活性相对较高的部分进行下一步分离。实验结果（见表1）表明：3个萃取层中以乙酸乙酯层活性最强，水层活性较弱；乙酸乙酯层经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱所得的F1提取物活性突出；F1提取物进一步分离得 F1B，提取物F1B具有较强的抑制 HUVEC增殖活性，抑制效果与其剂量浓度呈一定的依赖关系，在浓度为200 ug/ml其抑制率可达100%，IC50值为7ug/ml。
a 山慈菇不同萃取段及分离段提取物 b 提取物浓度在200 ug/ml时没有检测到活性
2.2 山慈菇提取物抑制CAM新生血管的形成
实验结果表明，生理盐水组的CAM血管整体色泽鲜红，血管粗大，血流量充盈，药膜处新生血管呈放射状和网状分布，血管丰富分支多，整体发育正常；Retinoic acid阳性药物对照组血管整体色淡浅黄，血管细小，血管数目减少，药膜片处血管减少明显，网状分支减少，说明Retinoic acid能明显抑制血管新生成；山慈菇提取物组（200ug/ml）血管整体色淡，形状细小零星分布，药膜下鲜有血管区，抑制血管新生成作用较Retinoic acid阳性药物对照组更为明显。特别是在抑制新生小血管数量方面与对照组相比差异具有显著性，且这种抑制同山慈菇提取物的给药剂量成一定的正相关，结果见图1。
图1山慈菇提取对CAM血管新生成抑制的影响
A生理盐水对照组B Rentinoic acid 阳性药物对照组C 山慈菇提取物F1B（200ug/ml）组D不同剂量的山慈菇提取物与Con（生理盐水对照组）和RA（Rentinoic acid阳性对照组）对CAM血管新生成抑制的影响，##p<0.01，* p<0.05，** p<0.01 ，vs Control
3结论与讨论
山慈菇作为传统中药材，具有清热解毒、化痰散结等功效，临床用于痈肿疔毒、瘰疬痰核等症。阮小丽等发现山慈菇对小鼠的Lewis肺癌、S180实体瘤和肝癌等均有显著抑制作用，且具有显著疗效。经过文献调研，发现山慈菇在抑制血管生成方面的研究还少见报道，因此本实验围绕山慈菇对HUVEC的增殖、CAM血管新生成抑制的影响进行了研究和探讨。
本研究发现，山慈菇提取物对HUVEC细胞的增殖有明显的抑制活性，这种抑制作用与不同萃取段和分离段有相关性，其中以乙酸乙酯萃取层（氯仿—甲醇）梯度洗脱的F1B提取物活性最为明显，IC50为7ug/ml。结果表明山慈菇提取物能够起到新生血管抑制活性。鸡胚尿囊血管实验作为体内血管抑制模型被广泛应用，本研究结果提示，山慈菇提取物对CAM血管新生有明显抑制活性，且与给药剂量呈正相关性。
从实验结果可以看出，山慈菇提取物能够抑制HUVEC细胞的增殖，以及体内血管的新生成，其抗肿瘤作用机制可能与此相关。因此山慈菇在作为肿瘤血管新生抑制剂方面具有较好前景。
参考文献
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作者简介：李余先，博士，吉林农业科技学院中药学院，吉林农业大学教育部生物反应器与药物开发工程研究中心，讲师，研究方向：中药资源与生物技术研究。
