RP—HPLC—ELSD同时测定绞股蓝中各成份含量
[摘要] 目的 用RP-HPLC-ELSD同时测定绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量。方法 采用Phenomenex C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）- 0.5%醋酸（B），梯度洗脱（0～5 min，10% A；5～27 min，10%～40% A，27.1 min，10% A；27.1～30 min，10% A），柱温30℃，流速1.0 mL/min，载气为N2，体积流量 2.0 L/min，雾化温度42℃，漂移管温度 65 ℃，增益5。结果 人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII在152.4～3048 ng（r=0.9996）、65.2～1304 ng（r=0.9998）、87.2～11744 ng（r=0.9998）、11.3～226 ng（r=0.9995）范围内的线性关系良好。平均回收率分别为100.05%、100.36%、100.82%、100.61% （n=9），RSD分别为1.77%、2.17%、2.31%、2.65%。9批绞股蓝样品含量范围：绞股蓝皂苷A 6.92～22.63 mg/g，人参皂苷Rb1 0～11.23 mg/g，绞股蓝皂苷XLIX 0～13.24 mg/g，七叶胆苷XVII 0～4.16 mg/g。结论 该方法测定绞股蓝中皂苷类成分含量灵敏、准确，分离效果较好，无干扰，可为完善绞股蓝中皂苷类成分的质量标准评价提供依据。
[关键词] 绞股蓝；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器
[中图分类号] R282.71 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2015）05（c）-0005-05
绞股蓝，又称天堂草、福音草、超人参、公罗锅底、遍地生根、七叶胆、五叶参和七叶参等，是Gynostemma pentaphyllum （Thunb.） Makino 葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物[1-2]。绞股蓝主要有效成份是绞股蓝皂苷、绞股蓝糖苷、水溶性氨基酸、黄酮类、多种维生素、微量元素、矿物质等[2-3]，现代药理研究表明[4-6]，绞股蓝具有保护心脑血管、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、调血脂、保肝、抗氧化、抗溃疡以及抗衰老等活性。绞股蓝开发的力度较大，但对其全面的质量控制还不够完善。另外，目前对绞股蓝中的人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII 5种成分同时测定的报道较少。因此，该文探讨用RP-HPLC-ELSD同时测定绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII 的含量，旨在完善绞股蓝的综合质量评价方法。
1 仪器与试药
Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Alltech 3300蒸发光散射检测器；YQ-1000A型超声清洗器（上海易净超声波仪器厂）；Sartorius BP211D分析天平（德国赛多利斯）；人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201122），供HPLC含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供；绞股蓝皂苷A对照品（批号：157752-0107）、绞股蓝皂苷XLIX对照品（批号：13080202）、七叶胆苷XVII对照品（批号：13050301），由成都成都曼思特生物科技有限公司提供。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为超纯水；绞股蓝药材购自全国不同地区，经该院药学部鉴定为葫芦科植物绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum（ Thunb. ）Makino 的干燥全草。
2 方法与结果
2.1对照品溶液的制备
取绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII对照品适量，精密称定，分别置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得单个对照品储备液，浓度分别为1.524 mg/mL、1.304 mg/mL、0.872 mg/mL、0.565 mg/mL。精密量取各对照品溶液量瓶中，甲醇稀释并定容，制成混合对照品溶液，浓度分别为：绞股蓝皂苷A 152.4 μg/mL、人参皂苷Rb1 65.2 μg/mL、绞股蓝皂苷XLIX 87.2 μg/mL、七叶胆苷XVII 11.3 μg/mL，即得。
2.2 供试品溶液的制备
取绞股蓝粉末（过3号筛）0.1 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声处理（功率250 W，80 kHz）30 min，过滤，滤液挥干，加水溶解，用水饱和正丁醇萃取至无色，合并萃取液，用氨试液洗涤2次，弃氨试液，减压蒸干，用甲醇定容至10 mL，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，即得。
2.3色谱条件
Phenomenex C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相：乙腈（A）-0.5%醋酸水（B），梯度洗脱（0～5 min，10% A；5～27 min，10%～40% A，27.1 min ，10% A；27.1～30 min，10% A），柱温30℃，流速1.0 mL/min，载气为N2，体积流量 2.0 L/min，雾化温度42℃，漂移管温度 65 ℃，增益5。理论塔板数按绞股蓝皂苷A峰计算不低于2000，见图1。
A B
1.绞股蓝皂苷A；2.人参皂苷Rb1；3.绞股蓝皂苷XLIX；4.七叶胆苷XVII 图1 混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）高效液相色谱图
2.4线性关系试验
精密吸取上述混合对照品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入色谱仪，以进样量的对数为自变量，色谱峰面积的对数为因变量，绘制标准曲线，建立回归方程，绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII在较大范围内线性关系良好，见表1。
表1 线性回归性分析
2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10 μL，以各峰面积的对数分别计算，结果：绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的RSD分别为1.64%、2.37%、2.36%、2.61%（n=5）。
2.6 稳定性试验
精密吸取新制备的同一供试品溶液（浙江永嘉），于0、2、4、6、8、10、12 h进样10 μL进行含量测定，计算RSD值。结果显示，绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量分别为7.11 mg/g、2.89 mg/g、2.41 mg/g、1.64 mg/g，RSD 分别为1.76%、2.13%、2.45%、2.33%，结果表明样品在12 h之内稳定性较好。
2.7 重复性试验
取同一批样品（浙江永嘉），共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样体积10 μL，以对数外标两点法计算含量，绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量分别为7.02 mg/g、3.12 mg/g、2.48 mg/g、1.56mg/g，RSD分别为1.97%、2.25%、2.51%、2.14%（n=6）。
2.8 加样回收率试验
取已经测定含量的样品（浙江永嘉）9份，每份约0.05 g，精密称定，按照供试品测定的绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII含量，以其一半的100%比例精密加入单个储备对照品溶液，再按照2.2项下方法制备供试品溶液，并按色谱条件测定样品，计算回收率，结果：绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的回收率分别为100.05%、100.36%、100.82%、100.61%（n=9），见表2。
2.9 样品含量测定
取所收集的9个不同来源绞股蓝药材，按照上述色谱条件下进样测定，以对数外标两点法计算绞股蓝中成分的含量见表3。
3讨论
绞股蓝号称“南方人参”， 在中国主要分布在陕西平利、甘肃康县、湖南、湖北，云南、广西等省，民间称其为神奇的“不老长寿药草”，1986年，国家科委在“星火计划”中，把绞股蓝列为待开发的“名贵中药材”之首位，2002年国家卫生部将其列入保健品名单[7]。绞股蓝具有减肥、降血脂、调血压、延缓衰老、预防冠心病、抑制癌细胞、调节人体生理机能、增强机体免疫力等功能，绞股蓝皂苷是其主要药效成分[8-10]。人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII均为绞股蓝中的皂苷类成分，文献报道采用紫外检测器测定绞股蓝中的皂苷类成分，检测波长在203 nm[11-13]；单一对某一绞股蓝中的皂苷类成分进行测定，对多种绞股蓝中的皂苷类成分同时测定较少。该实验采用反相高效液相色谱法，结合蒸发光散射检测器，建立了绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的测定方法，通过方法学考察，结果显示该方法快速、结果准确可靠，可作为绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的质量控制方法
该实验在流动相系统的考察中，对比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水等流动性系统，结果显示乙腈-水系统效果较为理想，分离效果俱佳，且加入0.5%醋酸的乙腈-水系统后，峰形对称性较好，对称因子均在0.95～1.05之间，能完成对人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的分离。因此，选择乙腈-0.5%醋酸系统作为流动相。该文采用梯度洗脱，梯度变化比例简单，克服了梯度过于复杂，难以操作，避免梯度复杂而导致重复性较低和基线不稳等现象出现，最终造成的是样品组分含量难以得到保证。而该文中各峰均能达到基线分离，能较好对4种成分的定性和定量。该文采用蒸发光散射检测器作为检测器，由于这4种皂苷类成分紫外最大吸收波长为203 nm左右，属于吸收末端，采用紫外检测器检测，物质相互间干扰较大，分离效果较差，而蒸发光散射检测器可以避免这类情况发生。
在对不同产地绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量比较，结果显示，绞股蓝皂苷A 6.92～22.63 mg/g，人参皂苷Rb1 2012（5）：5.
[7] 朴香兰，吴倩.绞股蓝研究进展[J].时珍国医国药，2010，21（7）：1758-1760.
[8] Tsui KC， Chiang TH， Wang JS，et al. Flavonoids from Gynostemma pentaphyllum exhibit differential induction of cell cycle arrest in H460 and A549 cancer cells[J].Molecules， 2014 ， 19（11）：17663-17681.
[9] Wu Q， Jang M， Piao XL. Determination by UPLC-MS of four dammarane-type saponins from heat-processed Gynostemma pentaphyllum[J].Biosci Biotechnol Biochem，2014，78（2）：311-316.
[10] Lin-Na S， Yong-Xiu S. Effects of polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）， Makino on physical fatigue[J].Afr J Tradit Complement Altern Med， 2014，11（3）：112-7.
[11] 史美荣，李华，白鸽，等.HPLC法测定绞股蓝中5种皂苷成分的含量[J].食品工业科技，2015，36（2）：49-51，56.
[12] 陈英.HPLC法测定绞股蓝中人参皂苷Rb1的含量[J].海峡药学，2013，25（9）：84-86.
[13] 张转平，王新权，胥道宝，等.HPLC法测定绞股蓝中绞股蓝皂苷A的含量[J].西北药学杂志，2008（2）：87-88.
（收稿日期：2015-03-02）
