鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究
[摘要] 目的 建立一个简单、稳定、重复性好的鸡胚背根神经节培养法测定mNGF活性的实验方法。方法 通过对鸡胚运输温度控制、神经节分离和接种时间限制、培养结果观察时间摸索、活性测定的浓度范围、重复性等试验，建立了鼠神经生长因子生物学活性的测定方法。 结果 该方法具有操作简便，灵敏度高、重复性好、测试结果准确的特点。结论 采用鸡胚背根神经节培养法可有效测定鼠神经生长因子的生物学活性。
[关键词] 鼠神经生长因子；mNGF；鸡胚背根神经节； 生物学活性测定
[中图分类号] R95 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）02（b）-0052-03
神经生长因子（nerve gowth factor，NGF）是神经系统最重要的生物活性分子之一，能够促进神经元的分化，维持神经元的存活[1]。鼠神经生长因子mNGF是一种从小鼠颌下腺分离出来的非共价键连接的多聚体蛋白。其生物学活性表现在能维持神经节细胞存活、诱导外周神经节外周突起生长[2]。鼠神经生长因子的生物学活性测定是其结构和功能研究的基础。目前， 国际上用于NGF 活性测定的方法主要有2种， 即鸡胚背根神经节培养法和PC12 细胞（Pheochromocytoma cells， 大鼠肾上腺嗜铬细胞） 培养法[3-4]。由于细胞培养法对操作人员的经验、细胞库管理、细胞培养环境、检测仪器等方面要求较高且设备设施投入大，故国内神经生长因子生物学活性测定的方法还是主要以鸡胚背根神经节培养法为主。但是鸡胚背根神经节培养法也存在干扰因素多，实验结果重复性较差的现象，故该文通过对鸡胚运输温度控制、神经节分离和接种时间限制、培养结果观察时间摸索、活性测定的浓度范围、重复性等试验，建立了一个简单、稳定、重复性好的鼠神经生长因子生物学活性的测定方法，有效地为鼠神经生长因子的生产过程监控和产品质量判定提供依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
CO2培养箱，解剖显微镜，超净工作台、，倒置显微镜等。
1.2 试剂
鸡胚：购于珠海东坑鸡场的石歧鸡种蛋；鼠神经生长因子样品：丽珠集团丽珠制药厂自制；鼠神经生长因子标准品：来自中国药品生物制品检定所，1 000 Au/支；DMEM：购于INVITROGEN 公司；鼠尾胶：丽珠集团丽珠制药厂自制。
2 实验方法
2.1 鼠尾胶原的涂布
取自制鼠尾胶原均匀涂布于培养瓶中。将残留液吸尽后，于37℃生化培养箱中干燥。在接种神经节前，培养瓶先用DMEM培养基浸洗，接种前将DMEM培养基倒尽。
2.2 DMEM培养基配制
取DMEM 1包，加葡萄糖0.60 g，L-谷氨酰胺0.02 g，1.5MHEAPS溶液1 mL加纯化水溶解，加青霉素1 000 U、链霉素10 000U，用碳酸氢钠调节pH=7.0后定容至1 000 mL，无菌过滤使用。
2.3 鸡胚背根神经节的分离和接种
取孵育7～9 d鸡蛋，于超净台中，取出鸡胚置于无菌培养皿中。于解剖显微镜下，从脊柱两侧分离出背根神经节，接种置培养瓶中。每瓶至少3个，于CO2培养箱中，37℃、5% CO2条件下温育至少1 h。
2.4 实验与培养
样品组（共6个培养瓶）每瓶分别加入含逐级3倍稀释的不同终浓度鼠神经生长因子的DMEM培养基各3 mL；标准品组（共5个培养瓶）每瓶分别加入含逐级3倍稀释的不同终浓度鼠神经生长因子标准品的DMEM培养基各3 mL；阴性对照组加入DMEM培养基3 mL。将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃、5% CO2条件下培养24 h。
2.5 结果观察
在倒置显微镜下观察，用电子目镜拍摄。依神经节突起生长不同程度分为5个等级。神经节突起生长4个象限、呈树杈状为“++++”；神经节突起生长3个象限、呈树杈状为“+++”；神经节突起生长2个象限者为“++”；神经节突起只有几根生长者为“+”；无突起生长者为“-”。
2.6 结果判定及校正
2.6.1 结果判定 以神经节突起生长为“++++”时的样品稀释倍数计算效价（AU/mL）。
2.6.2 按下列公式进行效价的校正 样品的活性（AU/mL）=参考品活性
3 实验结果与讨论
3.1 鸡胚运输温度条件实验
由于温度变化对鸡胚的生长发育有较大的影响，在气温较低的冬季，将种蛋分别用普通纸皮运输箱和采用保温泡沫箱内加电暖宝装置控制箱内温度在37℃左右的包装方式进行种蛋运输。取不同包装箱内的鸡胚摘取神经节接种后加入1 AU/mL的mNGF溶液或DMEM培养基后，放入CO2培养箱培养24 h后进行观察神经节的生长情况。结果见表1。
實验数据显示，鸡胚运输过程中采取保温泡沫箱内加电暖宝装置控制运输箱内温度在37℃左右，可以保证运输过程中鸡胚不被冻伤，接种后神经节不会脱落或因受伤神经节生长状态不好，造成实验结果差异较大。
3.2 神经节分离和接种时间控制实验
由于神经节需要在一定的温度、湿度下才能正常生长、发育。为保证神经节的生长成活率，进行了分离接种时间（神经节分离、接种到培养瓶放入CO2培养箱中）长短，对神经节的生长成活率的影响实验。取神经节接种后加入1 AU/mL的mNGF溶液后，放入CO2培养箱培养24 h后观察神经节的生长的存活率情况。结果见表2。
经过多次实验，观察到由于接种时间太长会造成神经节生长缓慢或因冻伤或失水而死亡，从而造成活性检测时出现样品无活性或无梯度等情况。认为保证在30 min内完成神经节分离、接种并进行温育，是本实验的关键步骤。对于在冬季气温较低的条件下进行mNGF活性检测；鸡胚背根神经节分离接种操作不熟练者；或同时进行多批次检品检测需接种较多培养瓶时时间控制显得尤其重要。因此，为保证神经节的成活率应将接种后的培养瓶及时放入CO2培养箱中进行温育。
3.3 培养结果观察时间摸索实验
由于神经节的培养时间不同，其生长状况不一样。通过不同培养时间下对实验结果的观察，认为培养24～36 h为观察结果的最佳时间。培养时间<24 h，神经节的生长状况未到达最佳状况，并且常常会因为培养瓶的反复移动造成神经节突起贴壁不牢固而出现回卷、包节的现象，以至于影响结果判断。培养时间>48 h，神经节的突起生长会变得更细、更长，出现活性梯度不明显同时也会因为神经节自身的抽丝生长背景较高而干扰结果判定。
3.4 mNGF量效学关系实验
采用鸡胚背根神经节培养法，摸索不同浓度的mNGF或不同效价单位的mNGF对神经节的生长状况的影响。结果见表3和图1。
利用鸡胚背根神经节培养法，在培养24 h后观察：在mNGF终浓度为0.1 ng/mL或0.03 AU/mL时，仅有少量神经节细胞突起生长为“+”；在mNGF终浓度为10 ng/mL或1 AU/mL时，有大量神经节突起呈放射生长为“+++”或“++++”，其神经节突起生长状况呈现出最好的状态。在mNGF终浓度>30 ng/mL或1AU/mL时，神经节突起生长受抑制为“+++”或“++”。
3.5 重复性测定
采用鸡胚背根神经节培养法，对3批产品的生物学活性测定进行了重复实验，检测6次结果，CV值小于20%。实验数据见表4。
4 结语
鸡胚背根神经节培养法实验条件要求简单，易于开展，并且可以观察到mNGF对神经节突起生长的促进作用。采用鸡胚背根神经节培养法mNGF生物学活性测定时需控制鸡胚37℃保温运输条件，并在30 min内完成神经节分离、接种温育，培养24 h后进行结果观察；且在mNGF的终浓度为0～30 ng/mL时，随着mNGF的终浓度升高神经节突起生长增多、增长；在mNGF的终浓度高于100 ng/mL或3AU时，神经节突起生长变密、变短、生长受到抑制；而在不加mNGF时，神经节则无突起或仅有少量突起生长。通过控制上述实验条件，该测定方法的CV值为%，因此，可采用鸡胚背根神经节培养法，进行鼠神经生长因子生物学活性的限量或半定量测定。该方法适合生产过程中对mNGF原液和制剂的质量控制。
[参考文献]
[1] 柳川，李晋萍，华仲慰，等.小鼠颌下腺2.5S神经生长因子的纯化与活性鉴定[J].军事医学科学院院刊，1987，11（1）：28-33.
[2] 王國华，陈南春，惠宏襄，等.小鼠领下腺神经生长因子的制备和活性鉴定[J].第四军医大学学报，1998，19（6）：646-648.
[3] 徐天瑞，董跃伟，熊郁良.两种测定神经生长因子活性方法的比较研究[J].药物分析杂志，2000，20（1）：17-19.
[4] 刘少平，杨国成，孟祥平，等.小鼠颌下腺2.5S神经生长因子生活学活性评估标准的建立[J]. 广西医学，2005，27（1）：50-51.
（收稿日期：2016-11-15）
