食品卫生检验中LAMP法和分离培养法检测沙门菌属的比较评价

[摘要] 目的 探讨食品卫生检验中LAMP法检测沙门菌属的实际应用效果。方法 将153份食品样品分别通过LAMP法和分离培养法检测沙门菌，比较两组阳性检出率。结果 LAMP法阳性检出率（14.38%）高于分离培养法（7.84%），差异有统计学意义（P<0.05）；两组阳性符合率为83.33%（10/12），阴性符合率为91.49%（129/141），差异无统计学意义（P﹥0.05）。结论 LAMP法应用于食品中沙门菌检测具有快捷、方便、阳性检出率高、结果准确等优点，值得推广。

[关键词] LAMP法；分离培养法；食品卫生检验；沙门菌属

[中图分类号] R155.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2015）08（a）-0031-02

沙门菌属是诱发细菌性食物中毒的主要致病因素之一，目前世界已知分离出的血清有二千多种，我国已知216种血清型。在食品卫生检测中沙门菌属是重要的检测项目之一，其致病性得到广泛关注，通过快速准确的方法检测沙门菌属对食品卫生安全非常重要。传统的分离培养法能够较为准确地检测出沙门菌属，但是其操作步骤非常繁琐，耗时耗力，不能及时得到检测结果，免疫学检测方法在对沙门菌属的敏感性较低，参考价值不理想，PCR法在灵敏度及特异度较好，但是PCR技术对于仪器设备的要求高，一般基层单位不具有检测条件，应用具有局限性。

环介导等温扩增法（LAMP）是一种新型的核算扩增方法，全名为Look-Mediated Isothermal Amplification，通过等温核酸扩增技术引导靶基因扩增产生DNA混合物，是一种高效，简便，检测沙门菌属特异性高的检测方法[1]。该研究于2015年1—6月通过检测153份食品样品，比较LAMP法和分离培养法检测食品中的沙门菌属的检出率，探讨其在食品卫生实际检验中应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

该研究选取2015年1—6月采集的153份食品样本作为检验对象，其中熟肉制品22份，冷冻生肉22份，生鲜肉22份，速冻米面制品22份，豆制品（非发酵）22份，生鲜水产品15份，鲜榨果汁10份，色拉制品8份，生食类蔬菜5份，冰糕5份，肠炎沙门菌为阳性目标控制菌株。

1.2检验方法

1.2.1 食品标本前增菌 依据《食品微生物学检验沙门氏菌检验》[2]标准，对采集的153份食品样本进行检验前增菌培养，取各样本25 g放入到装有225 mL缓冲蛋白胨水的无菌均值袋中，在拍打式均质器作用下连续拍击1～2 min，在37℃培养箱中培养12 h，冷冻样品在45℃环境下解冻15 min。

1.2.2 LAMP法 取食品前增菌各1 mL，在10 000 r/min下，对前增菌离心2 min，吸出上清液，将核算提取出来，另取上清液1 μL应用为DNA待检模板。通过文献[3]对引物进行设计，检测各样品中的DNA，反应体系（25 μL）：1.0 μL（40 μM FIP），1.0 μL（40 μM BIP），0.5 μL（10 μM F3）， 0.5 μL（10μM B3），2.5 μL（Buffer），3.5 μL（10mM dNTP）， 5.0 μL（5M Betaine），0.6 μL（250 mM MgSO4），1.0 μL（Bst DNA聚合酶），2.0 μL（DNA模板），加入ddH2O直至25 μL，将反应体系混匀放入65℃水浴箱中水浴1 h，然后在80℃下灭活，终止LAMP反应。终止反应后，通过肉眼观察，阳性为明显浑浊，反之为阴性。

1.2.3分离培养法 依据《食品微生物学检验沙门氏菌检验》标准中的方法，分别取1mL均匀震荡后的各样品前增菌，移入到10 mL TTB增菌液/10 mL SC增菌液内，分别在42℃/37℃下培养22 h，再取增菌液1环，分别接种到BS平板和XLD平板上，在37℃下培养22 h，选取3个可疑菌落接种至赖氨酸脱羧酶试验培养基、营养琼脂平板及TSI上，在37℃下继续培养22 h[4]。通过生化反应后，将初步符合沙门菌特征的可疑菌落从营养琼脂平板上取下，加入生理盐水，制成浊度适中的菌悬液，通过微生物鉴定仪进行分析。若BS平板/XLD平板上均无可疑菌落，将前者（BS平板）放置在37℃恒温箱中继续培养22 h，如没有可疑菌落，则可判定沙门菌为阴性[5]。

1.3统计方法

采用SPSS 18.0对数据分析，计数资料用率（%）表示，采取χ2检验分析，P<0.05说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1两种方法检测各样品阳性结果比较

153份食品样品中沙门菌LAMP法检出22份阳性样品，阳性率为14.38%；分离培养法检出12份阳性样品，阳性率为7.84%，两种方法阳性检出率比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 两组阳性符合率及阴性符合率

参照分离培养法检测，两组阳性符合率为83.33%（10/12），两组阴性符合率为91.49%（129/141），阳性符合率和阴性符合率比较差异无统计学意义（P﹥0.05），见表2。

3 讨论

环介导等温扩增法（LAMP）是日本荣研化学株式会社在2000年研发的一种新型核酸扩增技术，作用于靶基因的6个区域，设计4中特异引物，通过链置换DNA聚合酶，在恒定温度下作用30～60 min达到扩增作用[6]。具有易操作、高特异性的特点，扩增产物易被检测出来，通过浑浊程度肉眼便可判断沙门菌是否为阳性，检出率高，广泛应用于食品微生物检测中。传统的分离培养法参照《食品微生物学检验沙门菌氏检验》标准，需要对样品前增菌、增菌、离心、选出可疑菌落以及生化学检查鉴定等，一个检测过程需要4 d才可得到阴性检验数据，沙门菌检测结果需要一周时间才可得到[7]。操作繁琐、检测步骤较多，需在微生物鉴定系统的支持下对菌落进行分析，同时涉及到的试剂价格高，保质期较短[8]。相对于分离培养法，LAMP法只需对前增菌液提取核酸，展开扩增试验可在1 h内完成扩增，检测食品样品中的沙门菌可在24 h内完成，节省大量人力、物力和时间，阳性结果可以通过肉眼观察判断，结果安全可靠，在食品卫生检疫中具有重要意义。

该研究通过LAMP法和分离培养法两种途径对153种食品中沙门菌进行检测，结果表明LAMP法阳性检出率（14.38%）高于分离培养法（7.84%），具有统计学意义（P<0.05）；两组阳性符合率及阴性符合率比较中，以分离培养法作为参照，阳性符合率（83.33%）和阴性符合率（91.49%）均较高，无显著差异。

LAMP法是对沙门菌进行核酸检测，具有快捷、方便、阳性检出率高、结果准确等优点，但是不能分离菌株和鉴定分型，在实际检测工作中可以将LAMP法与分离培养法相结合，通过LAMP法确定阳性结果，分离培养法对菌落进行菌株分离和鉴定分型，提高工作效率。

[参考文献]

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[3] 袁发浒，尹欢，李琦，等.肠炎沙门菌的LAMP检测方法的建立[J].中国酿造，2013，32（4）：146-149.

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[6] 王帆，周石.肝动脉化疗栓塞联合氩氦刀治疗原发性肝癌疗效评价[J].介入放射学杂志，2005，14（6）：637-639.

[7] 于庆华.沙门菌属感染的诊疗[J].世界最新医学信息文摘：电子版，2013，13（14）：89，92.

[8] 叶文，杨柳青，张如胜，等.沙门菌属LAMP检测力法在食品卫生检验中的应用评价[J].中华疾病控制杂志，2011，15（9）：785-787.

（收稿日期：2015-05-11）