荧光PCR技术在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应用

[摘要] 目的 将实时荧光PCR技术应用于食品及公共场所从业人员肛拭标本的沙门菌与志贺菌检测，对国家卫生标准WS/T454-2014《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案进行实验认证，评价这一新技术开展作为快速检测从业人员体检肠道致病菌（伤寒、痢疾）检测工作方法的适用性，以替代落后的细菌培养法检测手段的可行性。 方法 对一定时间从业人员体检的肛拭子，同时用PCR筛查法和传统培养法进行志贺菌和沙门菌对比检测，充分比较两者的检出率、灵敏度、特异性、工作效率、人力成本和耗材成本。 结果 PCR筛查法阳性检出率1.6‰；传统培养法阳性检出率0.76‰；PCR筛查法的灵敏度和特异性分别为100%和99.97%，具有操作安全简便、结果客观性强、方法便于规范统一、质量控制措施可操作性强等特点。 结论 PCR筛查法检测技术对健康体检人员的肠道致病菌进行快速筛查可以使检验的时间得以缩短，而且特异度强、灵敏度高，兼具时效性与客观性，进而防止发生食物中毒及肠道传染病传播。更适合基层实验室规范统一地开展健康带菌检测工作。

[关键词]荧光PCR；伤寒痢疾；快速筛查

[中图分类号] R440 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2016）02（b）-0125-03

Realtime Fluorescence PCR Examination Method is in Rapid Detection of Salmonella and Shigella Among Employees

CHEN Ling，WEI Li-na，WU Bu-dong，FENG Zhen-yu，WANG Wei

Harbin Center for Disease Control and Prevention， Harbin，Heilongjiang Province，150000 China

[Abstract] Objective Real-time fluorescent PCR method was applied to food and public employees anus swabs of specimens of salmonella and shigella detection. FOR the experimental certification on national health standard （WS/T454-2014 ）. Evaluation applicability of this new method to carry out a rapid detection from employees on physical examination of intestinal pathogenic bacteria （typhoid and dysentery）. Methods Comparison test on anal swab of employees for a period of time by using the PCR method and the classic method at the same time . Fully compared their detection rate， sensitivity， specificity， efficiency， labor and material costs. Results The positive rate of PCR method is 1.6‰ and the classic method is 0.76‰. The sensitivity and the specificity of the PCR method is 100% and 99.97% respectively. Method is safe in operation to facilitate unified specification， quality control measures is strong operability， etc. Conclusion Real-time fluorescent PCR method allows rapidly detection of intestinal pathogenic bacteria .The method is high specificity， high sensitivity， both timeliness and objectivity to prevent the occurrence of food poisoning and the spread of intestinal infectious diseases. It is suitable for laboratory to carry out rapid detection from employees on physical examination of intestinal pathogenic bacteria normatively.

[Key words] Realtime PCR； Typhoid and dysentery；Rapid detection

食品与公共场所从业人员携带肠道致病菌者，是严重危害公众健康的重大问题，也是造成食品污染和食物中毒的间接因素。目前哈尔滨市对从业人员肠道致病菌的筛查一直沿用传统的国标方法，通常需要5～7 d才能检出病原体，存在检验时间长，灵敏度低的缺点[1]。WS/T454-2014《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案以经典培养法为依据，利用实时荧光PCR法灵敏、快速的优点和经典培养方法准确可靠的优点相结合，从而探讨建立高效、准确、省力的新方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对哈尔滨市2014年12月—2015年12月从业人员随机抽样，用肛拭子采集粪便标本11 800份，分别用传统和PCR两种方法进行检测，分比较两者的检出率、灵敏度、特异性、工作效率、人力成本和耗材成本，以评价新方法的可行性[2]。

1.2 仪器设备

（1）SLAN-96P全自动医用PCR分析仪；（2）SCAN-4全自动微生物生化鉴定仪（德国）。

1.3 试剂

（1）沙门氏菌和志贺氏菌双色实时荧光PCR检测试剂盒及配套采样器増菌液（深圳市生科源生物公司）[3]；（2）SS琼脂培养基、三糖铁琼脂（北京陆桥）；（3）沙门氏菌和志贺氏菌诊断血清（宁波天润）。

1.4 实验步骤

对11800份体检标本参照WS/T454-2014《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案用实时荧光PCR试剂盒进行实时荧光PCR检测[4]。

（1）标本采集。从业人员体检使用深圳市生科源技术有限公司生产的MABSKY多功能采样器（沙门/志贺通用增菌液型）进行标本采集。采样方法：第一，将采样杆缓慢插入肛门内2～3 cm，最大深入长度不超过5 cm，即采样杆指示刻度。第二，手腕部轻轻用力使采样头贴着直肠内壁顺时针旋转1～3圈。将采样杆轻缓抽出。

（2）标本增菌。第一，收集标本，并送至检验室。第二，掰断采样器头部，将采样器放入恒温培养箱内进行37 ℃恒温培养7～24 h。

（3）标本处理。①Pooling混合：先将pooling混合管（本案专配耗材，也可使用1.5 mL离心管代替）放置在配套的管架上，然后取前增菌后多功能采样器，掰断采样器头部，手指轻压采样器管壁，直接滴取2滴（约80 μL）至pooling管。按照每10份标本混合成1份混合标本的要求进行Pooling混合操作。

②离心：标本混合完成后，将模块和标本水平对称，离心机内以12 000 rpm的离心5 min。

③吸液、混匀：离心完后，首先弃上清，其次加DNA提取液50 μL/管，悬浮混匀。

④加热：将盛有混匀的标本于100 ℃加热5 min。

⑤再离心：标本加热完毕以后，放入离心机内以12 000 rpm的离心2 min。

⑥加样：第一，按照标本数（N）+ 阴阳性对照各一份，计算需要的实时荧光PCR试剂（N+2）；第二，取出分装配好的沙门志贺双色检测试剂8联PCR反应管放于离心甩液器上离心5 s，开盖待加样；第三，标本离心完毕后，从离心机内取出标本，然后取5 μL上清液， 加入到PCR反应管管壁内，盖好管盖转ABI7500仪器上机检测。

（4）荧光PCR检测。①标本检测：实时荧光PCR仪检测；②标本反应体系：总体积为25 μL；③ PCR反应条件：50 ℃：2 min，（1个循环）；95 ℃：3 min；（1个循环）；95 ℃： 5S，55 ℃：1 min采集荧光；（40个循环）。

（5）培养法确认与报告。①PCR检测阴性的标本：所有标本均报告为阴性。

②PCR检测沙门氏菌阳性的组，将混合标本所对应组（10份）标本挑出，进行沙门显色/XLD琼脂平皿划线分离培养。

③PCR检测志贺氏菌阳性的组，将混合标本所对应组（10份）标本挑出，进行XLD/麦康凯琼脂平皿分离培养。

④增菌后标本进行培养法后期生化血清鉴定。

同时对11 800份体检标本参照《食品卫生微生物学沙门氏菌检验》（GB-T4789.4-2003）和《食品卫生微生物学志贺氏菌检验》（GB-T4789.5-2003）进行检测。

2 结果

（1）两种方法阳性率对比，见表1。

总阳性率：PCR1.6‰，传统法0.76‰

（2）PCR检测结果准确率对照，见表2、表3。

表2 沙门氏菌检测结果准确率对照

灵敏度=A/（A+B）×100%=10/（10+0） ×100%=100%

特异性=D/（C+D） ×100%=11787/（3+11787） ×100%=99.97%

灵敏度=A/（A+B）×100%=9/（9+0） ×100%=100%

特异性=D/（C+D） ×100%=11789/（2+11789） ×100%=99.98%

3 讨论

该次实验11 800份标本中，检出沙门菌10例和志贺菌9例（以确诊病例为准），相比传统检测方法灵敏度提高[5]。在实际检测工作中，还为从业人员体检工作带来如下进步。

3.1 采样环节

（1）技术方案所配套的生科源“多功能采样器”为一体话专业设计，集合了采样环节所涉及的采样、运输、增菌、取样多功能需求。

（2）标本采集。多功能采样器已配置灭菌增菌液，省去了传统方法的采样瓶清洗、配液、消毒环节，可直接使用。既省去了传统方法采样器准备工作所需大量人工，也消除了该环节的污染风险；

（3）标本运输。多功能采样器采用全塑料组件，不破碎、不漏液，可避免标本运输过程意外产生的样本交叉污染[6]。

（4）取样检测。无需开启采样器瓶盖，避免标本取样的操作失误和标本污染[8]。

3.2 检测环节

（1）筛查结果仪器自动判读，消除主观因素；（2）检验时间大幅缩短；（3）PCR实验操作一人即可完成，减少了工作量；（4）检验数据电脑管理，原始结果可追溯。

该文PCR试剂应用改良分子信标设计。由于改良分子信标更短，与靶序列结合更紧密，扩增条件要求不严，是在基层能更好利用的PCR方法[8]。综合来看，该技术方案为整体技术方法，提供了从采样到PCR筛查所需要配套的多功能采样器、PCR试剂盒以及各技术环节的配套细节设计[9]。新技术方案是刚颁布的国家卫生标准，填补了这一领域的技术空白，是一个实用、简便、有效的技术规范。

[参考文献]

[1] 韩毅，孙燕萍，周虹.实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究[J].中国食品卫生杂志，2015（2）：132-135.

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[2] 尹荣焕，尹荣兰，杨玉英，等.PCR技术检测熟肉制品中沙门氏菌的研究[J].安徽农业科学，2006（2）：222，226.

[3] 刘华伟，郭蔼光，马立农，等.PCR技术在沙门氏菌快速检测中的应用[J].动物医学进展，2004（6）：55-58.

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